黃芪多糖、香菇多糖增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保護作用

謝榮華，范久波，舒衡平

黃芪多糖、香菇多糖增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保護作用

謝榮華1，范久波2，舒衡平3

目的 探討黃芪多糖(Astragalan)、香菇多糖(Lentinan)增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗刺激機體產生免疫應答和保護免疫的效果。方法 將黃芪多糖、香菇多糖分別與弓形蟲wx2b4a表位疫苗混合肌注免疫小鼠，ELISA法檢測小鼠血清中IgG抗體水平，pcDNA3-W2b4a刺激下培養各組小鼠脾臟淋巴細胞，ELISA法檢測IL-2、IFN-γ分泌水平，CCK-8法檢測免疫鼠脾細胞增殖活性，并觀察其受到弓形蟲攻擊感染后的生存時間。結果 各免疫組小鼠血清IgG抗體水平顯著高于對照組(P<0.05)，且pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組要高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組(P<0.05)；pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠脾細胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a組(P<0.05)；各免疫組T細胞增殖活性與對照組比較明顯增強(P<0.05)，且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組要高于pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組；小鼠攻擊試驗表明，pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠存活時間明顯長于對照組和pcDNA3-W2b4a組(P<0.05)。結論 黃芪多糖、香菇多糖可增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗產生免疫應答，并顯示較好的免疫保護效應。

弓形蟲；黃芪多糖；香菇多糖；表位疫苗；保護力

弓形蟲寄生引起的感染非常普遍，估計全世界約有1/3 的人感染,多數感染者無癥狀或癥狀輕微。但嚴重免疫缺陷的病人，如艾滋病人等，發生感染，后果就很嚴重。孕婦感染可致胎兒畸形、流產及死胎等。目前尚無理想的藥物及疫苗防治弓形蟲病,研究弓形蟲疫苗預防弓形蟲病是目前研究的熱點。本研究組在前期已構建了弓形蟲新基因wx2b4a 表位疫苗質粒[1],能夠誘導小鼠產生一定的抗弓形蟲感染保護性免疫[2]，但效果也不理想,非常需要用免疫佐劑來增強弓形蟲疫苗免疫原性,產生更有效和持久的保護性免疫，生物活性多糖是一類從植物、動物、微生物等生物體中提取的, 具有多種生物活性的碳水化合物。研究表明, 許多生物活性多糖具有免疫調節作用,且與其它免疫增強劑相比, 多糖具有毒副作用小、多效性、雙向調節性及來源廣等特點[3],成為當今研制新型免疫增強劑的發展方向之一。本研究探討黃芪多糖、香菇多糖能否增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗刺激小鼠機體產生免疫應答和保護免疫的效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒 弓形蟲RH株為本室傳代保種、pcDNA3、pcDNA3-W2b4a為本室構建。

1.2 實驗動物 6周齡昆明小鼠，雌雄各半，18～20 g，購自南華大學實驗動物中心。

1.3 主要試劑與藥物 HRP標記的羊抗小鼠IgG購自北京博大泰克公司；DMEM-H 基礎培養基、青霉素鏈霉素和胎牛血清購自Gibco公司；IL-2、IFN-γ小鼠細胞因子檢測ELISA試劑盒購自Excell公司；細胞增殖-毒性檢測試劑盒(cck-8)購自上海美季生物技術有限公司；香菇多糖注射液(金陵藥業股份有限公司福州梅峰制藥廠，國藥準字：H20030131)、注射用黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，國藥準字：220040086)

1.4 實驗動物分組及動物免疫 昆明小鼠115只，隨機分為5組，雌雄各半，分別為Ⅰ組：pcDNA3-W2b4a質粒100 μg，Ⅱ組:pcDNA3-W2b4a質粒100 μg +黃芪多糖(50 mg/kg/d)，Ⅲ組：pcDNA3-W2b4a質粒100 μg+香菇多糖(2.5 mg/kg/d)，Ⅳ組:pcDNA3 100 μg, V組:生理鹽水100 μL，將定量的黃芪多糖、香菇多糖分別與pcDNA3-W2b4a 質粒混合, 加PBS溶液至100 μL，從小鼠左后腿肌肉注射,每次100 μL,共免疫3次,每次間隔2周, 生理鹽水組和pcDNA3組作對照。

1.5 ELISA 法測定小鼠血清IgG 分別于免疫前及末次免疫后第2、4 周, 斷尾法取血，將每次所取血清樣品做1∶100稀釋，用間接ELISA法檢測免疫小鼠IgG抗體水平。按試劑盒說明書操作。

1.6 小鼠脾細胞懸液制備 小鼠末次免疫后2周,在攻擊實驗前,每組小鼠隨機處死8只，無菌取脾臟置于200目銅網,研磨后用1640培養液沖洗,收集脾細胞,破紅細胞后,加入含有10%小牛血清的1640培養液吹打混勻,將脾細胞數調整至5×106/mL,用于細胞因子釋放檢測和脾細胞增殖實驗。

1.7 細胞因子釋放檢測 加入含100 mL/L 胎牛血清和10 mL/L雙抗的DMEM-H培養基將每組脾細胞數調整為1×105/mL，每組分別取雙份100 μL加入24孔板中，加入10 μL pcDNA3-W2b4a質粒，在飽和濕度為50 mL/L CO2培養箱中37 ℃培養72 h后收集培養液上清，采用小鼠細胞因子ELISA檢測試劑盒，嚴格按照說明書要求操作，檢測IL-2、IFN-γ的水平。

1.8 免疫鼠脾細胞增殖實驗(CCK-8法) 將各組脾細胞懸液100 μL (2×104/mL)分別加入96 孔細胞培養板(每組設2個復孔和對照孔),各組分別加入ConA(終濃度為10 μg/mL), 對照孔不加入ConA,37 ℃,5%CO2培養48 h。于培養結束前4 h 各孔加入10 μL CCK-8試劑。培養結束后,吸去100 μL上清,測定時每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μL,振蕩溶解,用酶標儀測定吸光度(A450)

1.9 攻擊感染實驗 末次免疫后第4周，實驗組和對照組小鼠經腹腔注射弓形蟲RH株速殖子(500個/鼠)，觀察記錄小鼠的感染情況和死亡時間。

2 結 果

2.1 小鼠血清特異性IgG抗體水平 各免疫組小鼠特異性IgG抗體均高于對照組(P<0.05)，且均于末次免疫后第4周達到最高值；pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖及pcDNA3-W2b4a組IgG抗體水平較對照組同期要高(P<0.05)，且末次免疫后第4周pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖IgG抗體水平最高(A值為0.397±0.041)，而生理鹽水組IgG抗體水平最低(A值為0.121±0.057)(圖1)。

圖1 ELISA 法檢測小鼠血清IgG 的結果

2.2 細胞因子釋放檢測 以pcDNA3-W2b4a質粒刺激免疫小鼠脾細胞檢測IL-2 、IFN-γ細胞因子的分泌(圖2)。各免疫組小鼠脾細胞IL-2 、IFN-γ水平高于對照組(P<0.05)；pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠脾細胞IL-2 、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a組(P<0.05)(圖2)。

圖2 ELISA 法檢測小鼠脾細胞IL-2、IFN-γ 的結果

Fig.2 Detection of IL-2 and IFN-γ in splenoctes of mice by ELISA

2.3 免疫鼠脾細胞增殖實驗(CCK-8法) 末次免疫后2周,ConA 刺激小鼠脾T細胞,免疫組小鼠脾細胞均發生增殖。各組脾細胞增殖活性如下(加ConA孔的A值與不加ConA孔的A值的比值):pcDNA3-W2b4a:1.23，pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組:1.98, pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組：2.23,各免疫組脾淋巴細胞增殖能力與兩對照組比較明顯增強(P<0.05)。

2.4 抗攻擊感染的免疫保護作用 末次免疫后第四周每只小鼠經腹腔注射500個弓形蟲速殖子，實驗小鼠均未能耐受弓形蟲攻擊感染。疫苗組小鼠存活時間明顯長于pcDNA3組及生理鹽水組(P<0.05),且pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠存活時間長于pcDNA3-W2b4a組(P<0.05 )(表1)。

組 別Groups小鼠數量/只No.ofmice不同時間小鼠存活的數量/hNo.ofmiceindifferenttime/h144168192216240264288平均存活時間/hpcDNA3-W2b4a1515963110189±28*pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖15151496411220±31*#pcDNA3-W2b4a+AstragalanpcDNA3-W2b4a+香菇多糖15151487411218±26*#pcDNA3-W2b4a+LentinanpcDNA315141420000164±11生理鹽水1510000000151±7physiologicalsaline

注：*與對照組比較，P<0.05；#與pcDNA3-W2b4a比較，P<0.05。

Note: *As compared with the control group,P<0.05; # As compared with pcDNA3-W2b4a group,P<0.05.

3 討 論

本課題選用黃芪多糖、香菇多糖作為弓形蟲wx2b4a表位疫苗的佐劑，它們具有廣泛的藥理作用，也具有很強的免疫調節作用，可從多個方面發揮免疫調節作用：黃芪多糖可顯著增強非特異性免疫和體液免疫功能,提高免疫抑制小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF-a的水平，并可促進T淋巴細胞增殖[4]。代巧妹[5]等對急性弓形蟲感染的BALB/c小鼠采用香菇多糖預處理之后能有效的調節Tregs的數量和功能，從而調控Th1/Th2之間的動態平衡達到治療弓形蟲的作用。

表位疫苗已在寄生蟲疫苗的研究中獲得可喜的免疫效果，本課題組前期成功構建了弓形蟲多表位疫苗pcDNA3-W2b4a，并證實誘導小鼠產生一定的抗弓形蟲感染的作用[2]。本研究結果顯示：各免疫組小鼠血清IgG抗體水平顯著高于對照組，且pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組，各免疫組抗體水平均在末次免疫后第4周最高；各免疫組T細胞增殖活性與對照組比較明顯增強，且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組要大于pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組，這與王國秀[6]等研究認為協同ConA促進脾淋巴細胞增殖作用是香菇多糖大于黃芪多糖，促進脾淋巴細胞分泌IgG的是黃芪多糖大于香菇多糖的結果相一致。黃德尚[7]等研究黃芪多糖作為免疫佐劑能提高豬瘟疫苗對仔豬的免疫力,其作用機制與增加免疫球蛋白和促進豬瘟抗體形成有關。各免疫組小鼠脾細胞IL-2、IFN-γ水平高于對照組，pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠脾細胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a組，提示黃芪多糖、香菇多糖結合wx2b4a表位疫苗傾向于Th1型優勢的免疫應答。葛璞[8]等研究香菇多糖能夠有效激發弓形蟲RH株感染的BALB/c小鼠Th1型免疫應答的建立，對抗弓形蟲感染。王庭欣[9]等研究黃芪多糖對正常小鼠的細胞免疫、體液免疫及巨噬細胞功能均有明顯的增強作用。小鼠攻擊試驗表明，pcDNA3-W2b4a+黃芪多糖組、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖組小鼠存活時間明顯長于pcDNA3-W2b4a組和對照組。由此可見，黃芪多糖、香菇多糖可增強弓形蟲wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保護作用，可望用于弓形蟲亞單位疫苗的研制。

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DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.009

Shu Heng-ping, Email: hengpingshu@xysm.net

Enhancement of epitope vaccines fromwx2b4a

ofToxoplasmagondiipotency using Astragalan and Lentinan in mice

XIE Rong-hua1,FAN Jiu-bo2,SHU Heng-ping3

(1.EnvironmentBiologyofProfessionTechnologyCollegeinHunan,Hengyang421001,China;2.XiangfanCentralHospital,Xiangfan441021,China;3.DepartmentofParositology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

We observed the effect of Astragalan and Lentinan to enhance the immune response and protective immunity induced by the epitope vaccines fromwx2b4a ofToxoplasmagondiiin mice. Mice were immunized intramuscularly with Astragalan and pcDNA3-W2b4a, Lentinan and pcDNA3-W2b4a, respectively. The level of IgG antibodies of mice were detected by ELISA.Invitro, the levels of IL-2 and IFN-γ that were secreted from pcDNA3-W2b4a-stimulated splenocytes were also measured by ELISA. Proliferation of T cells was detected by CCK-8 and mouse survival challenged byT.gondiiwas observed. Results showed that after the immunization, the level of IgG antibodies in immunized groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05). The level of IgG antibodies in sera of mice inoculated with Astragalan and pcDNA3-W2b4a were higher than that in Lentinan and pcDNA3-W2b4a (P<0.05). After the immunization, the level of IL-2 and IFN-γ in splenoctes of mice inoculated with Astragalan and pcDNA3-W2b4a, Lentinan and pcDNA3-W2b4a were significantly higher than that those in GrouppcDNA3-W2b4a (allP<0.05). After the immunization, proliferation of T cells in immunized groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05). The proliferation of T cells inoculated with Lentinan and pcDNA3-W2b4a were higher than Astragalan and pcDNA3-W2b4a (P<0.05). Following challenging with RH tachyzoites, the mean survival time in Astragalan and pcDNA3-W2b4a group, Lentinan and pcDNA3-W2b4a group were significantly longer than those in Group pcDNA3-W2b4a (allP<0.05). It indicated that Astragalan and Lentinan could enhancewx2b4a immune response that exerts a superior immune protection, which might be a new practical strategy for developingToxoplasmagondiivaccines. Keywords:Toxoplasmagondii; Astragalan; Lentinan; epitope vaccine; protective efficacy

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.008

舒衡平,Email: hengpingshu@xysm.net

1.湖南環境生物職業技術學院，衡陽 421001； 2.湖北襄陽中心醫院，襄樊 441021； 3.中南大學湘雅醫學院，長沙 410078

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R382

A

1002-2694(2015)08-0724-04

2015-01-28；

2015-04-16

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