開封地區奶牛隱孢子蟲種類及基因型鑒定

趙金鳳，齊 萌，王海燕，化 軍，張 娜，張昆坡，李俊強，劉 群

開封地區奶牛隱孢子蟲種類及基因型鑒定

趙金鳳1,2，齊 萌2，王海燕3，化 軍3，張 娜2，張昆坡2，李俊強2，劉 群1

目的 探討開封地區奶牛隱孢子蟲感染情況和種類分布。方法 采用飽和蔗糖溶液漂浮法檢查新鮮糞便樣本的隱孢子蟲卵囊，用18S rRNA基因對隱孢子蟲進行PCR擴增和限制性片段長度多態性分析；基于gp60基因位點對微小隱孢子蟲進行基因亞型鑒定。結果 糞便樣本中隱孢子蟲陽性率為8.4% (52/622)，不同調查點、年齡段和養殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率具有統計學意義(P<0.01)。基于18S rRNA基因位點成功擴增出50個樣本，分別經SspI和MboII酶切進行鑒定，發現安氏隱孢子蟲為優勢蟲種，為23份，微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為5份、12份和6份，4份為牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染。序列分析顯示5個微小隱孢子蟲均為人獸共患基因亞型IIdA19G1。結論 開封地區奶牛感染人獸共患微小隱孢子蟲基因亞型，具有人獸共患傳播的可能性。

隱孢子蟲；基因型；鑒定；奶牛

ZHANG Kun-po2,LI Jun-qiang2,LIU Qun1

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種重要的人獸共患腸道原蟲，目前有27個種和70多個基因型，多數蟲種和基因型具有宿主特異性，對自然宿主的致病性也存在較大差異[1-3]。牛是人類隱孢子蟲病的重要傳染源，常見寄生于牛的有微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)，安氏隱孢子蟲(C.andersoni)，牛隱孢子蟲(C.bovis)和芮氏隱孢子蟲(C.ryanae)，牛還可感染其它10個隱孢子蟲蟲種/基因型[1,4]。其中，微小隱孢子蟲(C.parvum)主要引起未斷奶犢牛嚴重腹瀉甚至死亡，并可導致包括人在內的多種脊椎動物腹瀉；安氏隱孢子蟲主要引起斷奶后牛胃粘膜損傷和萎縮；牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲尚未發現明顯致病性[5]。

依據形態學觀察，安氏隱孢子蟲與其他3種隱孢子蟲易于區分，而微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲通過顯微鏡觀察難以區分。Feng等[6]建立了基于SspI和MboII限制性內切酶的PCR-RFLP能有效區分該4種隱孢子蟲，現常用于牛隱孢子蟲種類的分布研究。微小隱孢子蟲是3種重要的人獸共患隱孢子蟲之一，但并非所有微小隱孢子蟲分離株均可在人和動物之間進行傳播，基因亞型分析工具常用于隱孢子蟲群體遺傳結構鑒定和人獸共患風險評價[7-8]。目前微小隱孢子蟲基于gp60基因分為IIa-l共11個亞型家族，IIa和IId亞型家族可在人和反芻動物之間傳播，而IIc和IIe亞型家族僅通過人-人途徑傳播，其它亞型家族多具有宿主特異性[8]。本研究對開封地區奶牛進行隱孢子蟲感染調查，鑒定隱孢子蟲種類，并對微小隱孢子蟲(C.parvum)進行亞型分析。

1 材料與方法

1.1 樣本 2012年11月-2014年3月對開封地區4個奶牛養殖場和5個奶牛養殖小區隨機經直腸采集622頭奶牛新鮮糞便樣本，外觀均無明顯異常，每份10～30 g，裝入潔凈自封袋中，記錄信息，帶回實驗室，置4 ℃保存，48 h內檢測。

1.2 檢查方法 取5 g樣本，加30 mL自來水攪拌混勻，經40目不銹鋼糞篩過濾至50 mL離心管內；3 000 r/min離心3 min；棄上清，保留沉淀物；于沉淀物中加30 mL飽和蔗糖漂溶液，充分攪勻，3 000 r/min離心5 min；用鐵絲吊環蘸取表層漂浮液置載玻片上，加蓋玻片，400倍光鏡檢查。每片觀察200個視野，發現卵囊者即判定為陽性。

1.3 樣本DNA提取 取鏡檢為隱孢子蟲陽性的200 mg糞便樣本，用美國 OMEGA Bio-Tek生產的糞便DNA提取(Stool DNA Kit)試劑盒(D4015-02)按說明書步驟操作，提取的DNA置-20 ℃保存。

1.4 PCR和PCR-RFLP 18S rRNA和gp60引物及其反應程序分別參照Xiao等[9]和Alves等[10]的方法，引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。反應體系中加入模板DNA 1 μL，25 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，Mg2+1.5 μL，KOD-plus酶0.5 μL(日本TOYOBO公司生產)，加滅菌雙蒸水至25 μL，第2次PCR的模板為第1次PCR的1 μL產物。取5 μL PCR產物，與1 μL 10×Loading Buffer混合均勻，加入1%瓊脂糖凝膠加樣孔，每排第一孔加5 μL DNA Marker DL2000作對照，電泳結束后在電泳凝膠成像系統儀中觀察拍照。

參照Xiao等[11]和Feng等[6]的方法采用限制性內切酶SspI、MboII對18s rRNA基因擴增產物進行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，根據酶切圖譜鑒定隱孢子蟲蟲種。

1.5 測序 PCR產物測序委托北京諾賽基因有限公司完成，采用雙脫氧終止法進行雙向測序，測序儀為ABI PRISMTM3730 XL DNA Analyzer (Applied Biosystems，USA)。在GenBank上用Blast進行同源序列搜索，應用Clustal X 1.83進行比對分析。

1.6 統計學分析 采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 奶牛隱孢子蟲感染情況 糞便樣本中隱孢子蟲陽性率為8.4%(52/622)，不同調查點奶牛隱孢子蟲感染率具統計學意義(P<0.01)。5個養殖小區中有3個為隱孢子蟲陽性，感染率分別為4.5%(2/44)、9.4%(3/32)和1.4%(1/69)，不同養殖小區奶牛隱孢子蟲感染率具統計學意義(P<0.01)；4個養殖場均為隱孢子蟲陽性，養殖場1、2、3、4奶牛隱孢子蟲感染率分別為17.7%(14/79)、6.9%(10/145)、14.3%(12/84)和10.4%(10/96)，具統計學意義(P<0.05)。<30 d、31～60 d、61～120 d、121～180 d、181～360 d和>360 d奶牛隱孢子蟲感染率分別為13.9%(5/36)、9.5%(7/74)、13.8%(15/109)、7.1%(7/98)、9.0%(13/144)和3.1%(5/161)，不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染率具統計學意義(P<0.01)；規模化養殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率為11.4%(46/404)，顯著高于散養條件下2.8%(6/218)，不同養殖條件下奶牛隱孢子蟲感染率具統計學意義(P<0.01)。

2.2 PCR和PCR-RFLP結果 基于18S rRNA基因位點，52份陽性樣品中有50份成功擴增出830bp目的片段。經SspI和MboII酶切鑒定為安氏隱孢子蟲的有23份，微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為5份、12份和6份，混合感染的有4份，均為牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染。見圖1。

M. 100 bp DNA相對分子質量標準； 1-5：牛隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲的SspI酶切結果； 6-10：牛隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲的MboII酶切結果

M: 100 bp DNA marker; 1-5:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested bySspI enzyme; 6-10:C.bovis,C.bovis+C.ryanae,C.ryanae,C.andersoni, andC.parvumdigested byMboII enzyme.

圖1 18S rRNA基因PCR產物的限制性片段長度多態性分析結果

Fig.1 Results of PCR products of 18S rRNA gene digested by RFLP

2.3 不同養殖模式下奶牛隱孢子蟲種類分布 散養條件下的6個隱孢子蟲分離株成功擴增并進行RFLP， 2份為安氏隱孢子蟲，4份為牛隱孢子蟲。規模化飼養條件下的46個隱孢子蟲分離株有44份成功擴增并進行RFLP，安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲分別為21份、5份、8份和6份，4份牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲混合感染；4個養殖場中有3個發現有隱孢子蟲混合感染，僅在規模化4場發現微小隱孢子蟲感染。

2.4 不同年齡段奶牛隱孢子蟲種類分布 <30 d奶牛中發現5份微小隱孢子蟲感染；牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲主要感染31～180 d奶牛，分別為12份和6份，其余年齡段未見感染；23份安氏隱孢子蟲發現于>61 d奶牛，>180 d奶牛僅發現有安氏隱孢子蟲感染。31～60 d、61～120 d和121～180 d 奶牛的牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲混合感染分別為2份、1份和1份。

2.5 微小隱孢子蟲基因亞型序列分析 基于gp60基因位點對5份微小隱孢子蟲的PCR產物進行測序，所得序列在GenBank用Blast進行同源序列搜索，應用Clustal X 1.83 比對，結果顯示5條序列與人獸共患基因亞型IIdA19G1(HQ009809和DQ280496)序列同源性為100%，鑒定5個微小隱孢子蟲分離株為IIdA19G1亞型。

3 討 論

調查發現開封地區5個養殖小區中有3個為隱孢子蟲陽性場，4個奶牛養殖場中均為隱孢子蟲陽性場，表明該地區奶牛隱孢子蟲流行較為普遍，總感染率為8.4%，低于盧慶斌等[12]報道的河南省12月齡以內奶牛隱孢子蟲感染率(26.12%)，高于安徽省和黑龍江省奶牛隱孢子蟲的感染率(5.18%和5.3%)[13-14]。國內早期有關牛隱孢子蟲的調查和鑒定多采用傳統的形態學方法，對蟲種鑒定區分能力有限。梁楠等[15]采用SspI和VspI酶切鑒定自牛分離的大型卵囊均為安氏隱孢子蟲，與形態學觀察鑒定相一致。林潔等[16]采用SspI和MboII酶切鑒定渝西地區奶牛有3種隱孢子蟲，安氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲，以安氏隱孢子蟲為優勢蟲種；Wang 等[17]采用SspI和MboII酶切鑒定出河南省規模化奶牛場斷奶前犢牛感染4種隱孢子蟲，以微小隱孢子蟲和牛隱孢子蟲為優勢蟲種，并發現微小隱孢子蟲/牛隱孢子蟲、微小隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲、牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲/微小隱孢子蟲混合感染。本研究采用SspI和MboⅡ酶切鑒定隱孢子蟲，發現安氏隱孢子蟲為優勢蟲種，并發現牛隱孢子蟲/芮氏隱孢子蟲混合感染，與上述報告一致。

分析顯示，牛隱孢子蟲感染率隨年齡增長而下降，微小隱孢子蟲主要感染斷奶前犢牛，牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲主要感染幼齡牛和青年牛，而安氏隱孢子蟲常見于青年牛和成年牛[1,6,17-19]。Feng等[6]研究發現微小隱孢子蟲存在地方性流行，其鑒定上海5個斷奶前犢牛隱孢子蟲分離株4個為牛隱孢子蟲，1個為芮氏隱孢子蟲，1個斷奶后分離株為牛隱孢子蟲；而Liu等[14]報道黑龍江省低于2月齡犢牛未發現隱孢子蟲感染，27個斷奶后犢牛和成年奶牛隱孢子蟲分離株，26個為安氏隱孢子蟲，一個為芮氏隱孢子蟲，進一步證實微小隱孢子蟲存在地方性流行。本次調查不同年齡段奶牛隱孢子蟲感染率具統計學意義(P<0.01)，隨奶牛年齡增長隱孢子蟲感染率呈下降趨勢，與Wang 等[19]調查發現河南省斷奶后奶牛隱孢子蟲感染情況相符；不同年齡段奶牛隱孢子蟲蟲種分布也存在顯著差異，犢牛感染以微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和芮氏隱孢子蟲為主，而青年牛和成年牛以安氏隱孢子蟲為主，與Wang 等[17,19]報道均相一致。

牛隱孢子蟲感染與多種因素相關，如品種、環境、飼喂方式、管理因素、衛生狀況及季節，均可影響隱孢子蟲的傳播流行。發達國家牛隱孢子蟲感染和發展中國家存在差異，其幼齡牛感染蟲種也存在較大差異，研究認為與其飼養規模、牛舍分布和集約化飼喂程度密切相關，日本、印度、馬來西亞、澳大利亞和加拿大等國報道的放牧牛隱孢子蟲感染率低于規模化養殖場的奶牛[20,21]。本研究發現散養和規模化養殖條件下，奶牛腸道寄生蟲感染率具統計學意義 (P<0.01)，提示規模化養殖更易群體感染隱孢子蟲。

寄生于牛的4種隱孢子蟲中，微小隱孢子蟲是最常見的3種人獸共患蟲種之一[1]。國內奶牛養殖量大，地域分布廣，隱孢子蟲病特別是分子流行病學尚研究較少，對牛源微小隱孢子蟲人獸共患風險評估研究工作也開展較少。本研究通過分子生物學鑒定5個微小隱孢子蟲分離株均與先前河南省奶牛流行的人獸共患基因亞型IIdA19G1一致，為評估隱孢子蟲風險提供了依據，進一步表明奶牛源隱孢子蟲對人類構成潛在威脅，同時為我國奶牛源隱孢子蟲分子流行病學研究提供了基礎資料。

[1]Xiao L. Molecular epidemiology of cryptosporidiosis: An update[J]. Exp Parasitol, 2010, 124(1): 80-89. DOI:10.1016/j.exppara.2009.03.018

[2]Kvac M, Hofmannova L, Hlaskova L, et al.Cryptosporidiumerinacein. sp. (Apicomplexa: Cryptospo- ridiidae) in hedgehogs[J]. Vet Parasitol, 2014, 201(1-2): 9-17. DOI:10.1016/j.vetpar.2014.01.014

[3]Widmer G, Lee Y, Hunt P, et al. Comparative genome analysis of twoCryptosporidiumparvumisolates with different host range[J]. Infect Genet Evol, 2012, 12(6): 1213-1221. DOI:10.1016/j.meegid.2012.03.027

[4]Xiao L, Feng Y. Zoonotic cryptosporidiosis[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2008, 52(3): 309-323. DOI:10.1111/j.1574-695X.2008.00377.x

[5]Ralston B, Thompson RC, Pethick D, et al.Cryptosporidiumandersoniin Western Australian feedlot cattle[J]. Aust Vet J, 2010, 88: 458-460.

[6]Feng Y, Ortega Y, He G, et al. Wide geographic distribution ofCryptosporidiumbovisand the deer-like genotype in bovines[J]. Vet Parasitol, 2007, 144(1-2): 1-9.

[7]Widmer G, Sullivan S. Genomics and population biology ofCryptosporidiumspecies[J]. Parasite Immunol, 2012, 34(2-3): 61-71. DOI:10.1111/j.1365-3024.2011.01301.x.

[8]Waldron LS, Ferrari BC, Power ML. Glycoprotein 60 diversity inC.hominisandC.parvumcausing human cryptosporidiosis in NSW Australia[J]. Exp Parasitol, 2009, 122(2): 124-127. DOI:10.1016/j.exppara.2009.02.006.

[9]Xiao L, Escalante H, Yang CF, et al. Phylogenetic analysis ofCryptosporidiumparasites based on the small-subunit rRNA gene locus[J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(4): 1578-1583.

[10]Alves M,Xiao L, Sulaiman I, et al. Subgenotype analysis ofCryptosporidiumisolates from humans,cattle and zoo ruminants in Portugal[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6): 2744-2747.

[11]Xiao L, Bern C, Limor J, et al. Identification of 5 types ofCryptosporidiumparasites in children in Lima, Peru[J]. J Infect Dis, 2001, 183(3): 492-497.

[12]Lu QB, Qiu SX, Ru BR, et al. Epidemiological investigation of cryptosporidiosis in dairy calves in some prefectures of Henan Province[J]. Chin Vet Sci, 2008, 38(3): 261-267. (in Chinese) 盧慶斌, 仇書興, 茹寶瑞,等.河南省部分地區乳牛隱孢子蟲病的流行病學調查[J].中國獸醫科學, 2008, 38(3):261-267.

[13]Xu WL, Li PY, Gu YF, et al. Epidemiological survey of cow cryptosporidiosis in Anhui Province[J]. J Anhui Sci Technol Univ, 2007, 21(6): 9-11. (in Chinese) 徐文龍, 李培英, 顧有方, 等.安徽省奶牛隱孢子蟲病流行病學調查[J]. 安徽科技學院學報, 2007, 21(6):9-11.

[14]Liu A, Wang R, Li Y, et al. Prevalence and distribution ofCryptosporidiumspp. in dairy cattle in Heilongjiang Province, China[J]. Parasitol Res, 2009, 105(3): 797-802. DOI:10.1007/s00436-009-1457-2

[15]Liang N, Jian FC, Li JC, et al. Species identification of cryptosporidia isolated from dairy cattle by PCR-RFLP and phylogenetic analysis[J]. Chin Vet Sci, 2009, 39(1): 22-28. (in Chinese) 梁楠, 菅復春, 李家誠, 等.乳牛源隱孢子蟲種類的PCR-RFLP和分子種系發育分析鑒定[J]. 中國獸醫科學, 2009, 39(1):22-28.

[16]Lin J, Zhou RQ, Tan YC, et al. Isolation and genotype identification ofCryptosporidiumspp.in dairy calves in Western Chongqing[J]. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica, 2013, 44(3): 495-500. (in Chinese) 林潔, 周榮瓊, 譚燕財, 等. 渝西地區奶牛隱孢子蟲的分離和基因型鑒定[J].畜牧獸醫學報, 2013, 44(3): 495-500.

[17]Wang R, Wang H, Sun Y, et al. Characteristics ofCryptosporidiumtransmission in preweaned dairy cattle in henan, China[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 1077-1082. DOI:10.1128/JCM.02194-10

[18]Langkjaer RB, Vigre H, Enemark HL, et al. Molecular and phylogenetic characterization ofCryptosporidiumandGiardiafrom pigs and cattle in Denmark[J]. Parasitology, 2007, 134(Pt 3): 339-350.

[19]Wang R, Ma G, Zhao J, et al.Cryptosporidiumandersoniis the predominant species in post-weaned and adult dairy cattle in China[J]. Parasitol Int, 2011, 60(1): 1-4. DOI:10.1016/j.parint.2010.09.002

[20]Muhid A, Robertson I, Ng J, et al. Prevalence of and management factors contributing toCryptosporidiumsp. infection in pre-weaned and postweaned calves in Johor, Malaysia[J]. Exp Parasitol, 2011, 127(2): 534-538. DOI:10.1016/j.exppara.2010.10.015

[21]Amer S, Zidan S, Adamu H, et al. Prevalence and characterization ofCryptosporidiumspp. in dairy cattle in Nile River delta provinces, Egypt[J]. Exp Parasitol, 2013, 135(3): 518-523. DOI:10.1016/j.exppara.2013.09.002

Species and genotype identification ofCryptosporidiumin dairy cattle in Kaifeng, China

ZHAO Jin-feng1,2,QI Meng2,WANG Hai-yan3,HUA Jun3,ZHANG Na2,

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgricultureUniversity,Beijing100193,China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;3.DepartmentofAnimalScience,HenanVocationalCollegeofAgriculture,Zhongmu451450,China)

To identifyCryptosporidiumspecies and subtype in dairy cattle in Kaifeng, China, fresh fecal samples were detected by using the Sheather’s sugar flotation method, and theCryptosporidium-positive samples were identified with a restriction fragment length polymorphism analysis of the small subunit ribosomal RNA.C.parvumwas subtyped by using 60 kDa glycoprotein (gp60) gene. The infection rates ofCryptosporidiumspp. was 8.4% (52/622). Significant differences were observed between the infection rate of sampling sites, age and feeding condition (P<0.01). In the 18S rRNA gene, 50 isolates were successfully amplified, and the PCR product was digested with restriction enzymesSspI andMboII, respectively. The result showed thatC.andersoniwas the dominant species (n=23), as well as other species ofCryptosporidiumwereC.parvum(n=5),C.bovis(n=12) andC.ryanae(n=6), and the occurrence of infections with mixedC.bovisandC.ryanae(n=4). Sequence analyses ofgp60 gene revealed that five isolates were zoonotic subtype IIdA19G1. Dairy cattle infected zoonoticC.parvumsubtype in Kaifeng, which is of capability of potential transmission between human and animal.

Cryptosporidium; genotype; identification; dairy cattle

Liu Qun, Email: qunliu@cau.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.010

河南省高校科研創新團隊(No.012IRTSTHN005)和國家自然科學基金重點項目(No.31330079)

劉群, Email: qunliu@cau.edu.cn

1.中國農業大學動物醫學院， 北京 100193； 2.河南農業大學牧醫工程學院， 鄭州 450002； 3.河南農業職業學院動物科學系，中牟 451450

Supported by the Program for Science and Technology Innovative Research Team at the University of Henan Province (No. 012IRTSTHN005), and the State Key Program of the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079)

R382

A

1002-2694(2015)08-0733-04

2014-10-19；

2015-02-11