胃癌組織MUC1表達及其與幽門螺桿菌感染關系

侯中英，滕春媛，郭愛華，李媛，李林浩，戰淑慧

(1 青島大學醫學院附屬青島市市立醫院消化內科,山東 青島 266071； 2 青島市海慈醫療集團消化內科；3 青島市市立醫院普外科)

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胃癌組織MUC1表達及其與幽門螺桿菌感染關系

侯中英1，滕春媛2，郭愛華1，李媛1，李林浩3，戰淑慧1

(1 青島大學醫學院附屬青島市市立醫院消化內科,山東 青島 266071； 2 青島市海慈醫療集團消化內科；3 青島市市立醫院普外科)

目的 研究幽門螺桿菌(HP)對胃癌病人黏蛋白1(MUC1)表達的影響，探討HP感染影響胃癌浸潤轉移的機制。方法 建立HP感染胃癌AGS細胞系模型，Heochest33258染色觀察HP感染的AGS細胞形態學變化,Western blot方法檢測HP感染對AGS細胞MUC1表達的影響；免疫組織化學方法檢測96例胃癌組織中MUC1的表達。結果 Heochest33258染色顯示，HP感染后AGS細胞數目減少，細胞核出現濃縮、熒光染料濃聚等典型的凋亡現象。Western blot結果顯示，HP感染后AGS細胞MUC1表達上調；MUC1在HP感染的胃癌組織中表達率為67%(33/49),在HP陰性的胃癌組織中表達率為45%(21/47)，差異有統計學意義(χ2=5.008，P<0.05)。結論 HP感染影響胃癌組織MUC1的表達，HP感染引起MUC1蛋白表達上調可能促進胃癌轉移。

幽門螺桿菌；黏蛋白1；胃腫瘤；細胞凋亡；免疫組織化學

研究結果顯示，幽門螺桿菌(HP)是明確的胃癌Ⅰ類致癌因子[1-2]，HP感染增加胃癌浸潤轉移，但具體機制不十分明確[3]。黏蛋白是分布于消化道中起保護、潤滑黏膜細胞并參與局部固有免疫的一組高度糖基化的細胞外糖蛋白[4]，其表達或糖基化的改變可影響腫瘤侵襲、調節分化以及腫瘤細胞增殖[5]，黏蛋白1(MUC1)參與包括胃癌在內的多種腫瘤的形成[6]，且與淋巴結和靜脈侵襲有關[7]。為明確HP感染對胃癌MUC1表達的影響，探討HP感染增加胃癌轉移的機制，本文從細胞和組織兩個層面探討HP感染與胃癌MUC1表達的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2013年11月—2014年4月，青島大學醫學院附屬青島市市立醫院胃鏡室和手術室切除、并經病理診斷為胃癌的標本96例, 其中HP陰性47例，陽性49例。HP感染經病理和13C呼氣實驗結果明確診斷。HP菌種為我院消化內科分離培養，經過PCR測序為CagA(+)菌株菌種。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 HP感染胃癌AGS細胞模型建立 將HP菌種接種于含HP選擇性添加劑(SR0147E，Oxoid)和體積分數為0.05的脫纖維馬血的BHI培養基表面，37 ℃微需氧環境中培養4 d并傳代。胃癌AGS細胞應用含體積分數0.10胎牛血清、10 g/L青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養基進行常規培養和傳代。取對數生長期的AGS細胞接種于6孔板，于37 ℃下培養24 h，改用無抗生素的RPMI-1640培養基繼續培養，隨機分為對照組(未處理組)和HP感染組(觀察組)，每組設3個復孔。觀察組按感染復數(MOI)100加入HP[8]，對照組加入同等體積RPMI-1640培養液，繼續培養24 h。

1.2.2 胃癌AGS細胞凋亡檢測 用Hoechst33258熒光染色法，從恒溫培養箱中取出6孔板，按照產品說明書進行熒光染色操作，熒光顯微鏡下觀察兩組細胞的形態學改變和凋亡情況等并拍照。

1.2.3 胃癌AGS細胞MUC1表達檢測 HP感染AGS細胞24 h后收集細胞，提取細胞總蛋白，進行蛋白定量。取50 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE分離蛋白,PVDF膜進行轉膜，以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉，一抗分別為MUC1抗體和β-actin抗體，4 ℃下孵育過夜，加辣根過氧化酶標記的二抗兔抗鼠IgG抗體室溫下孵育1 h，TBS洗膜，ECL顯影，以β-actin作為內參。

1.2.4 胃黏膜標本中MUC1表達檢測 采用免疫組化方法，按照產品說明書步驟進行操作。MUC1單抗按說明書推薦的濃度用PBS溶液稀釋成工作液，以PBS液取代一抗作為陰性對照。按照染色程度評分：無色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。按照陽性細胞數進行評分,陽性細胞數<10%為0分,10%～30%為1分,31%～50%為2分,>50%為3分。染色程度計分與陽性細胞數計分相乘,0分為陰性(-),1～3分為弱陽性(+),4～5分為陽性(),≥6分為強陽性()。將陰性與弱陽性歸為陰性，將陽性和強陽性歸為陽性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組細胞凋亡情況的比較

熒光顯微鏡下觀察，對照組視野內呈微弱熒光，細胞染色質均勻，核形態規則，細胞密集排列，幾乎未見高亮熒光染色；觀察組視野見細胞數目較對照組減少，且散在高亮染色，細胞核染色質聚集成團塊狀及出現核碎裂等典型的細胞凋亡特征。

2.2 兩組胃癌AGS細胞MUC1表達比較

Western blot檢測結果顯示，觀察組AGS細胞MUC1表達強于對照組(圖1)。

胃癌組織中，MUC1陽性54例，陰性42例，MUC1陽性著色主要位于胞漿，部分表達于細胞膜上，著色深褐色，其中HP感染胃癌組織MUC1陽性表達率67%(33/49)，HP陰性的胃癌組織MUC1陽性表達率為45%(21/47)，兩組比較差異有顯著性(χ2=5.008，P<0.05)。

圖1 兩組細胞MUC1蛋白表達

3 討 論

HP為明確的胃癌致癌因子[1-2]，可以通過急性-慢性炎癥的持續存在以及基因型和表型的改變引起胃上皮細胞的基因不穩定性進而導致胃癌的發生與發展，而且HP感染可增加胃癌浸潤轉移的風險[3]。已證實MUC表達改變與腫瘤進展有密切關系[8]，MUC1是胃組織中主要表達的跨膜型MUC之一，因其在超過50%的胃癌中過度表達而被視為癌蛋白[9-10]。有研究表明，MUC1表達上調會導致E-鈣MUC表達的下調,使腫瘤相互間的黏附力下降，促進腫瘤轉移的發生[11]。為探討HP感染影響胃癌浸潤轉移的機制，本文從細胞水平上檢測HP感染后AGS細胞MUC1的表達，從組織水平觀察HP感染對胃癌組織MUC1表達的影響。熒光染色結果顯示，HP感染抑制AGS細胞的增殖，細胞數目減少，出現細胞核染色質聚集成團塊狀、核碎裂等典型細胞凋亡的形態學改變。已有研究結果顯示，細胞通過分裂、增殖和程序性死亡來維持自身的穩定，細胞程序性死亡包括細胞凋亡和自噬性死亡，當其中的動態平衡被打破，就可能導致腫瘤的發生。本實驗Western blot檢測結果顯示，AGS細胞感染HP后MUC1的表達上調，可能的機制為HP感染后活化STAT3序列進而激活MUC1的轉錄。該結果與TERADA[9]的研究結果相同。本文選取96例胃癌組織進行免疫組織化學染色，結果顯示HP感染組MUC1陽性表達率為67%,HP陰性的胃癌組織中陽性表達率為45%，兩組比較差異有顯著性，這與細胞水平上的研究結果相符合。然而，不同研究關于胃癌組織MUC1表達的結果并不完全相同，可能與選取標本的病人性別及腫瘤大小、浸潤深度、組織學類型、分化等有關[12-13]。

本文觀察HP感染對胃癌組織MUC1表達的影響，旨在探討HP感染影響胃癌轉移的機制，及MUC1等相關MUC在胃癌發生發展及早期檢測和預后評估中的應用[14-15]。研究結果顯示，HP感染會上調胃癌病人胃組織中MUC1表達。MUC1過度表達的胃癌病人預后較差[2,7,10],MUC1過度表達影響胃癌細胞的侵襲能力[7]，而侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本特征。本文結果提示，HP感染增加胃組織MUC1的表達可能與胃癌的侵襲性轉移相關，其相關分子機制還需要進一步研究。

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(本文編輯 黃建鄉)

MUC1 EXPRESSION IN GASTRIC CANCER AND ITS RELATION WITH HELICOBACTER PYLORI INFECTION

HOUZhong-ying,TENGChunyuan,GUOAihua,LIYuan,LILinhao,ZHANShuhui

(Department of Gastroenterology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China)

ObjectiveTo study the influence of helicobacter pylori (HP) infection on the expression of MUC1 in gastric cancer, and explore the effect of HP on infiltration and metastasis of this malignancy.MethodsA HP-infected AGS-cell-line model was created. Heochest33258 staining done to observe morphologic variations of AGS infected with HP, the effect of HP infection on the expression of MUC1 in AGS was detected using western blot, and the expression of MUC1 in 96 patients with gastric cancer was detected using immunohistochemical method.ResultsHeochest33258 staining showed that after HP infection, the number of AGS cells decreased, and typical manifestations of apoptosis-nucleus and fluorochrome concentrated-appeared. Western blot indicated after HP infection, the expression of MUC1 increased. The expression rate of MUC1 was 67% (33/49) in HP-positive gastric cancer versus 45% (21/47) in HP-negative, the difference being significant (χ2=5.008,P<0.05).ConclusionHelicobacter pylori infection affects MUC1 expression in tissue of gastric cancer, the up-regulation of MUC1 expression caused by Helicobacter pylori is likely to be one of the mechanisms to facilitate metastasis for this malignancy.

helicobacter pylori; mucin1; stomach neoplasms; apoptosis; immunohistochemistry

2014-12-13;

2015-05-16

青島市科技局科研基金資助項目(13-1-3-15-nsh)

侯中英(1988-)，女，碩士研究生。

戰淑慧(1962-)，女，主任醫師，教授，碩士生導師。

R735.2;R378

A

1008-0341(2015)04-0392-03