動態比濁快速鑒定金黃色葡萄球菌方法建立及應用評價

劉濤 ，黃艷芳 ，伍晨輝 ，宋秋月 ，陳開森

(1、南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學公共衛生學院檢驗班學生，江西 南昌 330006)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是臨床常見的致病菌，常導致院內感染和社區感染[1，2]，甚至食物中毒[3]，具有較高的發病率和病死率。研究資料表明金黃色葡萄球菌是最為常見的革蘭陽性感染菌，特別是近年來隨著耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的擴散，導致金黃色葡萄球菌感染的預防、治療更加棘手[4]。如何有效、快速、經濟地鑒別金黃色葡萄球菌具有重要的實際意義。目前大部分臨床實驗室鑒別金黃色葡萄球菌常采用商品化試劑及配套儀器，由于成本高，部分實驗室開展具有一定的困難。金黃色葡萄球菌有別于其它細菌的主要特點是其可產生血漿凝固酶（Plasma coagulase），故根據細菌的該生物特征能較好地鑒定金黃色葡萄球菌[5]。目前，部分實驗室，特別是基層實驗室常采用血漿凝固酶法檢測金黃色葡萄球菌，而常用的方法是試管法。然而，部分金黃色葡萄球菌凝固酶產酶量低，短時間內不易肉眼觀察，而常被認為假陰性；此外，少數菌株可產生葡激酶（Staphylokinase），可導致血漿凝集物解集，出現假陰性[6，7]。 在保證血漿凝固酶方法的有效檢測的前提下如何降低假陰性對金黃色葡萄球菌鑒別的影響具有重要臨床價值。本課題組根據現有經驗，摸索出一套采用動態比濁鑒別金黃色葡萄球菌的方法，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC2592 3），表皮葡萄球菌標準菌（ATCC26069），實驗室自留，購于中國菌種保存中心。臨床分離菌株經VITEK-2-compact鑒定，所有菌株的鑒定率（identi-fication rate）≥98%，包括金黃色葡萄球菌64株，非金黃色葡萄球菌114株。所有金黃色葡萄球菌經PCR擴增特異性耐熱核酸酶（nuc）基因進行再確定。

1.1.2 培養基 營養肉湯培養基及5%羊血瓊脂培養基均由實驗室自配，人EDTA抗凝混合血漿來源于本院常規體檢健康患者，所有操作符合全國臨床檢驗操作規程[8]。

1.1.3 主要試劑及儀器 VITEK-2-compact及其配套試劑購于法國梅里埃公司；Biotek比濁儀購于美國BIO-READ公司；恒溫培養箱、超凈工作臺為國產產品。

1.2 方法

1.2.1 確定動態比濁法檢測的最佳波長

1.2.1.1 菌液的制備 首先將金黃色葡萄球菌標準菌ATCC25923從-80℃低溫冰箱取出，常溫復蘇1小時后接種于肉湯，搖勻后用接種環挑取1環接種于血平板上，37℃培養16~18h，操作前取血平板上2~3個菌落接種到肉湯中37℃培養2~3h，隨后3000r/min離心3min，倒棄肉湯，用無菌生理鹽水調整菌液沉淀使濃度為1個麥氏單位。陰性對照采用表皮葡萄球菌標準株ATCC26069。

1.2.1.2 操作步驟 向96孔板中的每孔加入血漿90 μl及菌液 10μl， 將反應混合液放置于 340nm、405nm、450nm、540nm、590nm 和 630nm 波長下檢測吸光度值的變化，反應溫度為37℃，設定檢測時限6h，每2min檢測一次。如果吸光度值增大0.05，則認為反應體系的吸光度值有變化 （儀器本身設定），并認為菌株產生了血漿凝固酶。

1.2.2 動態比濁法檢測金黃色葡萄球菌的特異性為了觀察該方法鑒別金黃色葡萄球菌是否具有特異性，我們對臨床分離的64株金黃色葡萄球菌、114株革蘭染色陽性非金黃色葡萄球菌的球菌進行鑒別。具體方法如下：加入10μl濃度為1麥氏單位菌液到 90μl混合人血漿中，340nm、37℃反應，每隔2min判讀吸光度值，共計6h。

1.2.3 動態比濁法檢測金黃色葡萄球菌的敏感性為了觀察動態比濁鑒別金黃色葡萄球菌的敏感性，我們比較分析試管法和動態比濁法對88株金黃色葡萄球菌的鑒別時限。具體方法：動態比濁法為加入10μl濃度為1麥氏單位的金黃色葡萄球菌菌液到90μl混合人血漿中，340nm、37℃反應，設定每隔2min判讀吸光度值，共計6h。試管法則是向小試管內加入50μl濃度為1麥氏單位的金黃色葡萄球菌菌液，同時加入450μl混合人血漿，37℃反應，每隔30min判讀是否出現凝集，共計6h。

1.2.4 動態比濁法對臨床分離金黃色葡萄球菌的快速鑒定 參照VITEK-2-compact對菌株的鑒定，這些菌株包括葡萄球菌、腸球菌等革蘭染色陽性的球菌共計189株，標本的分離、培養及鑒定符合臨床檢驗操作規程[8]。具體方法：加入10μl濃度為1麥氏單位的菌液到90μl混合人血漿中，340nm、37℃反應，設定每隔2min判讀吸光度值，共計6h。

1.3 數據分析 以VITEK-2-compact檢測結果作為參考方法，χ2檢驗分析2h或6h動態比濁和試管法檢測血漿凝固酶的差別；u檢驗分析動態比濁與試管法檢測血漿凝固酶的敏感性差異。

2 結果

2.1 方法的可行性 為了了解動態比濁法檢測金黃色葡萄球菌是否可區別于其它細菌，我們采用金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌標準菌株進行檢測分析，結果如圖1所示：金黃色葡萄球菌標準株（ATCC25923）的吸光度值隨反應時間延長而上升（OD≥0.05），而表皮葡萄球菌標準株（ATCC26069）的吸光度值一直處于水平狀態。

圖1凝固酶陽性葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌反應曲線

2.2 反應最佳波長 參照儀器本已固定設定的340nm、405nm、450nm、490、540nm 和 630nm 波 段進行檢測，6h內每隔10~20min對吸光度值進行測定，相同時間內，340nm處的OD值升高最快，且一直維持在高水平，故認為變化最為敏感，從而我們認為340nm處檢測效果最好。見圖2。

2.3 動態比濁法的特異性和敏感性 采用試管法血漿凝固酶作對照，分析動態比濁法的敏感性和特異性。結果表明2h內64株金黃色葡萄球菌中共計58株（90.9%）被鑒定，而試管法僅鑒別38株（59.4%），χ2檢驗無差別（χ2=3.42，P=0.064），但陽性出現的時間差異明顯 （u=3.26，P＜0.001）；6h 內動態比濁法鑒別63株（98.4%），而試管法僅鑒別54株（84.4%），χ2檢驗值沒有差別（χ2=0.46，P=0.50），但鑒別結果陽性出現時間明顯早于試管法 （u=2.39，P＜0.01）（表 1）。

圖2不同時間、不同波長下動態比濁體系OD值變化曲線

表1 動態比濁與試管法診斷金黃色葡萄球菌相關參數

2.4 臨床菌株鑒定 采用動態比濁法隨機對臨床分離的189株革蘭染色陽性球菌鑒別是否為金黃色葡萄球菌，發現所有的88株金黃色葡萄球菌被鑒別出（鑒別準確性100%）；而101株非金黃色葡萄球菌僅1株鑒定為陽性，后經VITEK-2-compact確定為中間葡萄球菌，故認為動態比濁法鑒別金黃色葡萄球菌結果可靠。

3 討論

金黃色葡萄球菌是臨床常見的致病性革蘭陽性菌，常導致中毒及社區、醫院感染，對金黃色葡萄球菌的快速準確診斷是治療的前提條件。目前雖然商品化試劑獲得廣泛使用，但成本較高，基礎實驗室較難開展。血漿凝固酶試驗方法簡單，幾乎每個實驗室都可開展，聯合菌落形態，溶血情況等可準確地對金黃色葡萄球菌進行快速鑒別[8]。然而，由于試管法檢測血漿凝固酶的敏感度低，故短時間內不能有效地對金黃色葡萄球菌進行鑒別，如表1所示，2h內其鑒別率僅為0.594。反應時間過長則產生的葡激酶對纖維蛋白復合物水解而導致假陰性。本研究根據血漿凝固酶可水解纖維蛋白原為纖維蛋白，導致血漿吸光度值升高，設計了動態比濁法檢測血漿凝固酶，反應曲線見圖1。通過對不同波長檢測獲得結果的分析，發現最佳檢測波長為340nm（圖2），這與文獻報道有些差異[9]，考慮到作者加入藥物對體系的影響，故認為兩者間差異較小。

動態比濁法的主要優勢體現在不間斷地實時檢測反應體系中吸光度值的變化，這種變化肉眼不能判斷，故速度更快、更準確。因為金黃色葡萄球菌具有較強的致病能力且常導致食品中毒，故更快地獲得確切的結果對于有效地控制疾病的進展及其預防和治療具有重要的價值。

商品化試劑檢測金黃色葡萄球菌雖然操作簡便，但需時較長且昂貴。試管法血漿凝固酶則需要較多的人力，如果全部鑒別出，往往需要培養過夜。對于病情嚴重或食物中毒患者而言，及時鑒定的時間往往可決定病情的進展及治療的預后。本研究在對臨床分離的189株革蘭陽性球菌采用參考方法進行鑒別檢測時，88株金黃色葡萄球菌全部被檢測出，而采用6h動態比濁法共計檢測到87株菌，鑒定符合率達98.9%（87/88）；相同時間采用的試管法檢測率僅為檢測到75株，鑒定符合率為85.2%，兩者出現鑒別結果的時間點差異明顯 （u=2.39，P＜0.01）；如果以2h作為時間點來觀察，時間出現的順序差異則更加明顯（u=3.26，P＜0.001）。 如果將試管法進行過夜培養判斷，雖然可檢測出血漿凝固酶含量低的菌株，但考慮到金黃色葡萄球菌可產生葡激酶對纖維蛋白復合物的水解而導致假陰性，故陽性率與6h判斷差異不大[11]。動態比濁法克服了試管法的上述缺陷，表現為檢測能力更敏感，且可實時地監測體系OD值變化，故可觀察到葡激酶對復合物的水解作用（表現為OD值下降）。相比于試管血漿凝固酶法對金黃色葡萄球菌的鑒定，動態比濁法僅需動態比濁器而幾乎不需要配套耗材，故不存在成本增加及工作量增大的問題。考慮到檢測時間及敏感性的優勢，故我們認為該方法可有效地代替試管法檢測血漿凝固酶鑒別金黃色葡萄球菌。

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