Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)及其HPA軸功能失衡

壽旗揚，張利棕，蔡月琴，方 鵬，倪琳慧，徐劍欽，盛佳萍，方明筍，陳民利

(1.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，2.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院；浙江杭州 310053）

Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)及其HPA軸功能失衡

壽旗揚1，張利棕1，蔡月琴1，方 鵬2，倪琳慧2，徐劍欽1，盛佳萍2，方明筍1，陳民利1

(1.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，2.浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院；浙江杭州 310053）

目的對Lewis大鼠腎陽虛體質(zhì)及其HPA軸功能進行研究。方法 采用氫化可的松皮下注射法和切除腎上腺損傷HPA法建立大鼠腎陽虛模型，同時Lewis大鼠與兩種實驗性腎陽虛模型進行比較，并用一般體征、行為學、神經(jīng)內(nèi)分泌功能等檢測和方法評估Lewis大鼠腎陽虛程度。結果 與正常Wistar大鼠比較，Lewis大鼠體重明顯重于同周齡的Wistar大鼠，但體溫、尿量和抓力明顯低于Wistar大鼠(P＜0.01），Lewis大鼠的記憶能力有下降趨勢，Lewis大鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腎上腺指數(shù)明顯降低(P＜0.01），血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH）、促腎上腺皮質(zhì)釋放激素(CRH）、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP）、皮質(zhì)醇(Cort）和尿17-羥皮質(zhì)類固醇(17OHCS）明顯降低(P＜0.01）。結論 因基因遺傳而致Lewis大鼠腎上腺皮質(zhì)功能減退，Lewis大鼠具有先天性腎陽虛體質(zhì)-臨界性腎陽虛證或腎陽虛證前期。

Lewis大鼠；腎陽虛體質(zhì)；HPA軸功能失衡

腎陽是人體生命活動的原動力，為人體生命之根本［1］。腎陽虛動物模型的建立可為腎陽虛的疾病研究及補腎助陽方藥藥效的研究提供研究工具。常見的腎陽虛模型有腎上腺皮質(zhì)功能抑制、甲狀腺功能抑制、性腺功能受抑、恐傷腎，老年腎陽虛及房勞傷腎模型等［2，3］，其中外源性糖皮質(zhì)激素所致的腎虛模型應用最為廣泛。鄺安堃教授首次建立了“氫化考的松腎陽虛”動物模型，是通過注射大劑量氫化可的松使垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH）釋放減少，動物出現(xiàn)一系列“耗竭”現(xiàn)象，其類似腎陽虛證的臨床表現(xiàn)［4，5］。

腎陽虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡密切相關，是多系統(tǒng)和器官功能的綜合表現(xiàn)。大量實驗研究證明，腎陽虛調(diào)控樞紐定位在下丘腦［6，7］，下丘腦-垂體-腎上腺軸/甲狀腺軸/性腺軸的功能障礙和功能低下是腎陽虛證的基礎［8，9］。研究報道Lewis大鼠體內(nèi)存在著下丘腦-垂體-腎上腺 軸功能(hyPothalamic-Pituitary-adrenal，HPA）的缺陷［10，11］，且易感實驗性腦脊髓炎、類風濕關節(jié)炎等自身性免疫性疾病。在正常應激時，HPA軸是免疫調(diào)節(jié)的負反饋環(huán)路，在HPA軸功能低下時，機體易患自身免疫性疾病；是因為皮質(zhì)類固醇能抑制Th1細胞的產(chǎn)生，Th1細胞則分泌IL-2、TNF-γ和TNF-α，這些細胞因子能刺激B淋巴細胞而產(chǎn)生大量的自身抗體；同時皮質(zhì)類固醇還可誘導TGF-β生成［12］。我們前期實驗也證明了Lewis大鼠體內(nèi)存在下丘腦-垂體-腎上腺軸功能缺陷，Lewis大鼠血清皮質(zhì)醇水平顯著低于正常Wistar大鼠血清皮質(zhì)醇水平［13］。我們根據(jù)以上結果推斷，認為Lewis大鼠可能具有腎陽虛體質(zhì)。

因此，本課題擬用氫化可的松皮下注射法和切除腎上腺損傷HPA軸法建立大鼠腎陽虛模型，同時取Lewis大鼠與前兩種實驗性腎陽虛模型進行比較，并用一般體征、行為學、神經(jīng)內(nèi)分泌功能等檢測和方法評估Lewis大鼠腎陽虛程度，擬構建一種大鼠自發(fā)性腎陽虛體質(zhì)模型，為補腎中藥的開發(fā)和應用提供現(xiàn)代研究的依據(jù)和可靠的腎陽虛中醫(yī)動物模型。

1 材料

1.1 試劑

氫化可的松注射液，100 mg/20 mL(5 mg/mL），5支/盒，天津金耀藥業(yè)有限公司，20130415。大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH）、皮質(zhì)醇(CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH）、環(huán)磷酸腺苷(cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP），尿17-羥皮質(zhì)類固醇(17-OHCS）ELISA檢測試劑盒，上海拜沃生物科技有限公司；戊巴比妥鈉：規(guī)格：25 g/瓶，含量 ＞99.0％，批號：WS20120112，德國進口分裝。

1.2 動物

雄性SPF級 Lewis大鼠，7～8周齡，體重為(240～260）g，10只；北京維通利華實驗動物有限公司【生產(chǎn)許可證：SCXK(京）2012-0001】。雄性SPF級Wistar大鼠，7～8周齡，體重為(220～240）g，30只，中國科學院上海實驗動物中心/上海斯萊克實驗動物有限公司【生產(chǎn)許可證：SCXK(滬）2012 -0002】。大鼠腎上腺切除手術在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心 SPF級屏障手術室中進行［SYXK(浙）2013-0184］。試驗中所有實驗動物飼養(yǎng)、使用和操作均按3R原則給予人道關懷。

1.3 儀器設備

AG204-電子分析天平，瑞士Mettler；AF100雪花狀制冰機，美國 Scotsman；725型 -86℃低溫冰箱，美國Forma；Smart-MASS小動物行為記錄分析系統(tǒng)，西班牙Panlab；MLS-3020高壓滅菌鍋，日本三洋公司；DK-450B型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；BG-270隔水式電熱恒溫箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SPX-150B生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；VarioScan Flash波長多功能酶標儀，芬蘭Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 氫化可的松法（Hydrocortisone，HYD）腎陽虛模型建立

取20只7～8周齡Wistar大鼠，預飼養(yǎng)10 d后，按體重均勻分為Wistar正常組(A組）、Wistar-HYD組(B組），共3組，每組10只。Wistar-HYD組大鼠進行氫化可的松法腎陽虛模型建立，采用氫化可的松皮下注射15 mg/kg造模，每日1次，連續(xù)造模3周。

2.2 切除腎上腺損傷 HPA 軸法（Bilateral adrenalectomy，BA）腎陽虛模型建立

取10只7～8周齡Wistar大鼠，設立Wistar-BA組(C組），預飼養(yǎng)3 d后，Wistar-BA組大鼠進行切雙側(cè)除腎上腺損傷HPA軸法腎陽虛模型建立，大鼠腹腔注射3.0％戊巴比妥鈉，麻醉劑量為45 mg/kg，剔去腹部被毛消毒，在腹中線縱向切口，切除大鼠雙側(cè)腎上腺，術后以0.5％葡萄糖生理鹽水代飲水，恢復7 d后，連續(xù)觀察3周。

2.3 Lewis大鼠腎陽虛體征與兩種常用實驗性模型的比較及藥物反證

取10只7～8周齡Lewis大鼠，預飼養(yǎng)10 d后，設立Lewis組(D組）。通過以下各種指標去評價Lewis大鼠腎陽虛體征及HPA軸功能失衡，連續(xù)觀察3周。

2.4 大鼠一般體征的觀察

對各組大鼠的體重、肛溫、飲食量、飲水量、尿量進行觀察。造模結束時觀察大鼠自主活動情況。大鼠自主活動的測試：將大鼠放入自主活動儀中，在安靜避光的環(huán)境中，安靜1 min后，測5 min內(nèi)大鼠自主活動次數(shù)。

2.5 大鼠行為學觀察

2.5.1 開場實驗：各組大鼠進行開場實驗。圓形敞箱，高40 cm，直徑80 cm，周壁、底面為黑色，并劃定直徑40 cm的中央?yún)^(qū)。每只動物測定1次，每次測定5 min。將大鼠置于圓形敞箱底面的中心，用數(shù)碼攝像機視頻監(jiān)測和記錄大鼠軌跡，軌跡記錄為水平運動大鼠的活動度，同時記錄大鼠后肢直立次數(shù)記錄為垂直運動次數(shù)了解大鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度，并計數(shù)大便粒數(shù)。保證實驗室內(nèi)暗光、安靜，兩次實驗之間將箱底打掃干凈。實驗完畢用小動物行為記錄分析系統(tǒng)分析大鼠水平運動總距離、中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)滯留時間和中央?yún)^(qū)進入總次數(shù)。

2.5.2 Morris水迷宮測試：開場實驗結束后進行Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力。水迷宮水池高50 cm，直徑120 cm，站臺直徑10 cm，站臺高出水面2 cm，水溫(22±0.5）°C，水池、日光燈、鼠籠等實驗室各種物件的位置保持不變。在安靜環(huán)境下，數(shù)碼攝像機監(jiān)測大鼠活動情況，利用小動物行為記錄分析系統(tǒng)對其活動進行全程跟蹤，并顯示整個活動軌跡。實驗采用1 d訓練1次。若動物2 min尚未找到站臺，將動物拿到站臺上并使它在上面停留20 s。訓練4 d后進行水迷宮測試，記錄120 s內(nèi)找到站臺所需的時間即逃避潛伏期。

2.6 血清ACTH、CORT、CRH、cAMP、cGMP、17-OHCS測定

各組大鼠用3％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，心臟取血置離心管中，3 000 r/min離心10 min，分離血清，參照ELISA試劑盒說明書測定血清大鼠CRH、CORT、ACTH、cAMP、cGMP，尿17-OHCS。

2.7 統(tǒng)計學方法

用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤差(±s）表示，計量資料應用ANOVA方差分析評價試驗結果，兩兩比較采用LSD檢驗。

3 結果

3.1 腎陽虛模型大鼠體重和體溫的變化

由表1結果可見，各組實驗前，與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠在試驗前體重無明顯差異，而Wistar-BA組在試驗前進行了雙側(cè)腎上腺切除手術導致體重明顯降低(P＜0.01），Lewis組大鼠由于動物品系差異Lewis大鼠體重明顯高于同周齡的Wistar大鼠(P＜0.01）。實驗后，與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠每日皮下注射15 mg/kg氫化可的松后體重急劇降低(P＜0.01），Wistar-BA組大鼠與自身比較體重升高，但與正常組比明顯降低(P＜0.01），Lewis組大鼠體重明顯高于同周齡的正常Wistar大鼠(P＜0.01）。一般觀察上，Wistar-HYD組和Wistar-BA組大鼠毛松、豎毛、毛發(fā)失去光澤，而Lewis組大鼠外形無異常。

與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠注射氫化可的松3周后，體溫急劇降低(P＜0.01），Lewis組大鼠體溫明顯低于Wistar正常大鼠(P＜0.01），而Wistar-BA組大鼠體溫無明顯變化(P＞0.05），這與腎陽虛臨床癥狀相悖，分析原因可能是由于腎上腺切除手術引起。

3.2 腎陽虛模型大鼠采食量、飲水量和尿量變化

由表2結果可見，與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠飲水量明顯升高(P＜0.01），尿量有升高的趨勢(P＞0.05）；而Wistar-BA組大鼠飲水量和尿量明顯升高(P＜0.01）；Lewis組大鼠采食量和飲水量無明顯變化(P＞0.05），尿量略微明顯升高(P＜0.05）。

表1 大鼠體重和體溫變化(±s，n=10）Tab.1 Changes of body weight and body temPerature in the rats(±s，n=10）

表1 大鼠體重和體溫變化(±s，n=10）Tab.1 Changes of body weight and body temPerature in the rats(±s，n=10）

注：與Wistar正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.ComPared with the normal Wistar rat grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

第3周體溫Body temPerature，3 wks(℃）Wistar正常組Normal Wistar rats 249.88±11.03 300.13±10.40 320.50±10.57 38.10±0.20 Wistar-HYD組HYD grouP Wistar rats 250.89±11.22 223.00±14.08** 220.11±14.08** 36.26±0.88** Wistar-BA組BA grouP Wistar rats 182.29±18.90** 235.14±36.90** 253.00±41.04** 37.33±0.91 Lewis組Lewis rat grouP 299.78±12.60** 335.22±18.63** 357.22±20.34** 36.88±0.81**組別GrouPs第0周體重Body weight，0 wk(g）第2周體重Body weight，2 wks(g）第3周體重Body weight，3 wks(g）

表2 大鼠采食量、飲水量和尿量變化(±s，n=10）Tab.2 Changes of feed intake，water intake and urine volume in the rats(±s，n=10）

表2 大鼠采食量、飲水量和尿量變化(±s，n=10）Tab.2 Changes of feed intake，water intake and urine volume in the rats(±s，n=10）

注：與Wistar正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.ComPared with the normal Wistar rat grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別GrouPs尿量Urine volume(mL/24 h）Wistar正常組Normal Wistar rats 15.825±3.535 20.650±5.561 9.046±2.909 Wistar-HYD組HYD Wistar rats 13.822±4.279 34.044±7.446** 11.498±3.335 Wistar-BA組BA Wistar rats 16.729±4.547 46.44±12.04** 26.059±9.782** Lewis組Lewis rat grouP 14.600±3.959 19.722±10.320 12.688±3.762*采食量Feed intake(g/24 h）飲水量Water intake(mL/24 h）

3.3 腎陽虛模型大鼠抓力、自主活動、記憶能力等指標的變化

由表3結果可見，與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組、Wistar-BA組和Lewis組大鼠抓力明顯降低(P＜0.01）；Wistar-HYD組大鼠的自主活動時間明顯降低(P＜0.05），而Wistar-BA組大鼠自主活動時間有升高趨勢，Lewis組大鼠僅在開場實驗垂直運動次數(shù)中有降低的趨勢。

與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠的開場中水平運動總距離、中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)滯留時間和中央?yún)^(qū)進入總次數(shù)均顯著降低(P＜0.01）；Wistar-BA組大鼠的開場中水平運動總距離無明顯變化(P＞0.05），而中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)滯留時間和中央?yún)^(qū)進入總次數(shù)均有升高的趨勢(P＞0.05）；Lewis組大鼠的開場中水平運動總距離顯著降低(P＜0.01），而中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)滯留時間和中央?yún)^(qū)進入總次數(shù)均有降低趨勢(P＞0.05）(圖1）。

在水迷宮實驗中，上平臺時間為大鼠從入水到找到平臺時間代表了大鼠記憶能力。與Wistar正常組比較，Wistar-HYD組和Lewis組大鼠的上平臺時間有延長的趨勢(說明大鼠記憶能力下降），Wistar-BA組大鼠的上平臺時間明顯延長(P＜0.05）。

表3 大鼠抓力、自主活動、記憶能力等指標變化(±s，n=10）Tab.3 Changes of holding Power，sPontaneous activities and memory ability in rats(±s，n=10）

表3 大鼠抓力、自主活動、記憶能力等指標變化(±s，n=10）Tab.3 Changes of holding Power，sPontaneous activities and memory ability in rats(±s，n=10）

注：與Wistar正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.ComPared with the normal Wistar rat grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

Lewis組Lewis rat grouP抓力/Holding Power(g） 1681.5±169.2 686.7±128.7** 979.0±131.8** 1107.6±214.3**自主活動/SPontaneous activity(5 min） 98.11±13.41 72.20±24.72* 110.25±12.80 109.10±24.25垂直運動次數(shù)/Number of vertical movement(n/5 min） 20.22±7.68 13.00±7.30 26.25±6.27 14.50±3.37大便數(shù)/Number of defecation(n/5 min） 1.22±1.48 2.00±1.76 1.00±1.07 0.90±1.29水平運動總距離/Total distance of horizontal movement(cm） 8569.7±723.7 5643.8±1090.7** 8324.0±790.4 7206.4±1106.4**中央?yún)^(qū)運動距離/Central movement distance(cm） 1248.2±328.4 637.0±159.2** 1413.5±388.5 993.6±431.4中央?yún)^(qū)滯留時間/The central residence time(s） 34.0±8.7 20.3±8.6** 46.3±13.4* 28.5±11.9中央?yún)^(qū)進入總次數(shù)/Total number of entry into central region(n/5 min） 23.2±6.5 12.6±5.2** 30.0±6.5* 18.3±9.2項目Items Wistar正常組Normal Wistar rat grouP Wistar-HYD組HYD Wistar rat grouP Wistar-BA組BA Wistar rat grouP水迷宮逃避潛伏期/EscaPe latency Period(s） 27.44±9.80 38.00±30.86 60.25±29.74* 41.50±18.13

圖1 各組大鼠開場試驗水平運動總距離、中央?yún)^(qū)運動距離等的變化(A：Wistar正常組；B：Wistar-HYD組；C：Wistar-BA組；D：Lewis組）Fig.1 Changes of the total distance of horizontal movement and central movement distance in the rats tested by oPen field.(A：Normal Wistar rat grouP.B：HYD Wistar rat grouP.C：BA Wistar rat grouP.D：Lewis rat grouP）

3.4 腎陽虛模型大鼠臟器重量和臟器指數(shù)變化

由表 4結果可見，與 Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、腎上腺指數(shù)和肺臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01）；Wistar-BA組大鼠腎臟指數(shù)和肺臟指數(shù)明顯升高(P＜0.01，P＜0.05）；Lewis組大鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腎上腺指數(shù)明顯降低(P＜0.01）。

3.5 腎陽虛模型大鼠血清ACTH、CRH、cAMP、cGMP、Cort和尿液17-羥皮質(zhì)類固醇（17OHCS）變化

由表 5結果可見，與 Wistar正常組比較，Wistar-HYD組大鼠血清ACTH、cAMP、cGMP、Cort和尿液17OHCS明顯降低(P＜0.05，P＜0.01）；Wistar-BA組大鼠血清ACTH、Cort和尿液17OHCS明顯降低(P＜0.01）；Lewis組大鼠血清 ACTH、CRH、cGMP、Cort和尿液17OHCS明顯降低(P＜0.01），說明Lewis組大鼠未經(jīng)干預處理自發(fā)性出現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)釋放激素(CRH）-促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH）-皮質(zhì)醇(cortisol）軸(HPA軸）功能低下的情況。

表4 腎陽虛模型大鼠臟器指數(shù)變化(g/kg體重，±s，n=10）Tab.4 Changes of visceral indexes in the rats(g/kg body weight，±s，n=10）

表4 腎陽虛模型大鼠臟器指數(shù)變化(g/kg體重，±s，n=10）Tab.4 Changes of visceral indexes in the rats(g/kg body weight，±s，n=10）

注：與Wistar正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.ComPared with the normal Wistar rat grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別GrouPs心臟指數(shù)Cardiac index肝臟指數(shù)Liver index脾臟指數(shù)SPleen index腎臟指數(shù)Kidney index腎上腺指數(shù)Adrenal gland index肺臟指數(shù)Lung index Wistar正常組Normal Wistar rats 3.199±0.337 39.565±2.459 2.131±0.198 6.605±0.374 0.148±0.013 4.124±0.358 Wistar-HYD組HYD Wistar rats 3.878±0.410** 43.438±1.398** 4.038±1.489** 7.698±0.398** 0.189±0.024** 5.649±0.433** Wistar-BA組BA Wistar rats 3.700±0.724 42.781±6.742 2.565±0.593 7.563±1.026* / 5.631±0.952** Lewis組Lewis rats 3.055±0.208 32.440±1.441** 2.297±0.201 7.056±0.226** 0.121±0.015** 3.937±0.319

表5 腎陽虛模型大鼠血清ACTH、CRH、cAMP、cGMP、Cort和尿17OHCS變化(±s，n=10）Tab.5 Changes of serum ACTH，CRH，cAMP，cGMP，Cort and urine 17OHCS in rats(±s，n=10）

表5 腎陽虛模型大鼠血清ACTH、CRH、cAMP、cGMP、Cort和尿17OHCS變化(±s，n=10）Tab.5 Changes of serum ACTH，CRH，cAMP，cGMP，Cort and urine 17OHCS in rats(±s，n=10）

注：與Wistar正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.ComPared with the normal Wistar rat grouP，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別GrouPs促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH (Pg/mL）促腎上腺皮質(zhì)釋放激素CRH (Pg/mL）17-羥皮質(zhì)類固醇17OHCS (μmol/L）環(huán)磷酸腺苷cAMP (nmol/L）環(huán)磷酸鳥苷cGMP (nmol/L）皮質(zhì)醇Cort (ng/mL）Wistar正常組Normal Wistar rats 120.1±14.7 112.7±22.8 95.15±6.69 49.15±5.42 20.07±1.61 538.43±35.60 Wistar-HYD組HYD Wistar rats 97.8±8.3** 92.9±14.9 86.68±5.62* 43.55±2.77* 18.04±1.54* 406.96±27.58** Wistar-BA組BA Wistar rats 95.1±8.4** 91.2±14.3* 84.18±5.70** 41.92±7.69 17.55±2.77 396.26±36.91** Lewis組Lewis rats 51.9±6.7** 70.6±13.8** 78.65±5.93** 44.12±3.44* 15.90±1.34** 451.73±25.69**

4 討論

腎陽虛證是腎陽虛衰表現(xiàn)的證候。腎陽為諸陽之本，腎陽虛的中醫(yī)辨證為“主癥：腰膝酸痛，畏寒肢冷，性欲減退，舌質(zhì)胖大，苔白，脈沉［5］。常見于虛勞、哮喘、泄瀉、水腫、陽痿等，建立有效的動物模型在腎陽虛證研究工作中不可缺少的一個重要環(huán)節(jié)［14］。目前最常用的腎陽虛模型為氫化可的松腎陽虛模型。氫化可的松腎陽虛模型是用一定量外源性糖皮質(zhì)激素使垂體前葉的ACTH釋放受到抑制，進而使腎上腺皮質(zhì)分泌類固醇激素減少，導致動物出現(xiàn)一系列的“耗竭”現(xiàn)象，腰膝酸軟，性功能低下，畏寒肢冷，精神不振，氣短而喘，消瘦、尿夜白濁等病理狀態(tài)［15，16］。模型動物的下丘腦視上核甲細胞數(shù)減少，乙細胞數(shù)增加，CRF mRNA表達降低；肝細胞中線粒體破壞，肝細胞RNA含量降低，肝細胞中各種酶活性下降，肝糖元減少；免疫器官、免疫細胞損害而免疫低下等［17，18］。

下丘腦損害和功能紊亂是腎陽虛證的主要病理基礎，下丘腦-垂體-甲狀腺、腎上腺、性腺不同環(huán)節(jié)和不同程度的變化，是腎陽虛證的主要病理環(huán)節(jié)。該模型的內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素分泌受到抑制，但在皮下注射后大劑量外源性糖皮質(zhì)激素可導致在注射后1 h左右體內(nèi)外源性糖皮質(zhì)激素水平急劇升高，有與腎陽虛患者下丘腦-垂體-腎上腺軸功能減退、血漿皮質(zhì)醇減少的病理變化相左。因為外源性糖皮質(zhì)激素干預可治療某些自身免疫性疾病，因此，在建立某些腎陽虛病證結合模型(如腎陽虛型類風濕關節(jié)炎、哮喘）中存在一些問題，該模型存在一定局限性。

神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡的整合中樞在下丘腦。免疫系統(tǒng)不僅有神經(jīng)內(nèi)分泌激素受體，還能合成神經(jīng)遞質(zhì)和內(nèi)分泌激素，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的細胞因子能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)又能合成細胞因子及其受體，對其發(fā)生反應。由此構成神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡［19］。機體受到刺激后 HPA軸活性增強，HPA軸作為神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡的樞紐不僅在機體內(nèi)環(huán)境平衡中起重要作用，而且能調(diào)節(jié)機體衰老過程。應激反應的中樞效應主要發(fā)生在HPA軸，而下丘腦的室旁核是HPA軸活動的直接控制部位［20］。Lewis大鼠體內(nèi)存在下丘腦-垂體-腎上腺軸功能缺陷，我們推斷Lewis大鼠可能具有腎陽虛體質(zhì)。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，與正常Wistar大鼠比較，Lewis大鼠體重明顯重于同周齡的Wistar大鼠，但體溫、尿量和抓力明顯低于Wistar大鼠(P＜0.01），Lewis大鼠的記憶能力有下降趨勢，Lewis大鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腎上腺指數(shù)明顯降低(P＜0.01），血清ACTH、CRH、cGMP、Cort和尿液17OHCS明顯降低(P＜0.01）；Lewis大鼠因基因遺傳而致腎上腺皮質(zhì)功能有所減退。以上結果證明了Lewis大鼠具有先天性腎陽虛體質(zhì)-臨界性腎陽虛證或腎陽虛證前期，因Lewis大鼠基因遺傳而致腎上腺皮質(zhì)功能有所減退，有極輕度的腎陽虛癥狀，亦可稱Lewis大鼠為隱性腎陽虛動物，在中醫(yī)理論中屬“未病”范疇。為我們下一步全面評估Lewis大鼠腎陽虛模型及病癥結合模型打下了堅實基礎。

［1］張文軍，孫升云.從表觀遺傳學探討中醫(yī)“腎為先天之本、脾為后天之本”理論 ［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2015，32 (3）：559-565.

［2］陳英華，歐陽軼強，孫琪，等.腎陽虛證動物模型規(guī)范化研究中診斷指標選擇的初步探討 ［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2003，9(10）：746-750.

［3］孫蓉，楊倩.腎陽虛證動物模型研制進展與中藥藥效評價的思考 ［J］.藥物評價研究，2010，33(1）：22-24.

［4］鄺安堃，吳裕，丁霆，等.某些助陽藥對大劑量皮質(zhì)激素所致耗竭現(xiàn)象的影響［J］.中華內(nèi)科雜志，1963，11(2）：113.

［5］彭成.“氫化考的松陽虛”動物模型的反思 ［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，1998，4(2）：55-57.

［6］蔡定芳，沈自尹，張玲絹，等.右歸飲對大鼠下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸功能抑制模型的影響［J］.中國免疫學雜志，1994，10(7）：236-239.

［7］蔡定芳，沈自尹，陳曉紅，等.烏頭堿對大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響 ［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，1996，16(9）：544-546.

［8］歐陽軼強，鄒移海，張薇，等.對大鼠他巴唑腎陽虛證動物模型下丘腦-垂體-靶腺軸幾項指標的考察［J］.中醫(yī)藥學刊，2006，24(9）：1658-1661.

［9］沈自尹.腎的研究(續(xù)集）［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1990：313.

［10］Sternberg EM，Young WS 3rd，Bernardini R，et al.A central nervous system defect in biosynthesis of corticotroPin-releasing hormone is associated with suscePtibility to strePtococcal cell wall-induced arthritis in Lewis rats［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86(12）：4771-4775.

［11］Sternberg EM，Hill JM，Chrousos GP，et al.Inflammatory mediator-induced hyPothalamic-Pituitary-adrenal axis activation is defective in strePtococcal cell wall arthritis-suscePtible Lewis rats［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86(7）：2374-2378.

［12］Newson MJ，Roberts EM，PoPe GR，et al.The effects of aPelin on hyPothalamic-Pituitary-adrenal axis neuroendocrine function are mediated through corticotroPhin-releasing factor-and vasoPressindePendent mechanisms［J］.J Endocrinol，2009，202(1）：123-129.

［13］傅惠英，壽旗揚，蔡月琴，等.鹽酸奧芬米洛對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能的影響［J］.甘肅中醫(yī)學院學報，2013，30(2）：1-4.

［14］張琰，鄧樹泳，馬娜，等.腎陽虛動物模型的現(xiàn)代研究進展［J］.中國老年學雜志，2014，34(3）：838-841.

［15］施玉華，馬正立，汪麗亞，等.中藥復方對小鼠氫化考的松模型肝切片的組織學與組織化學研究［J］.中醫(yī)雜志，1983，(5）：382-385.

［16］彭成.補腎壯陽液的藥理研究 ［J］.中藥藥理與臨床，1994，(特）：17.

［17］施玉華.動物模型在中醫(yī)藥理論形態(tài)學研究中的應用 ［D］.北京：全國中醫(yī)藥動物模型研討會論文匯編.1993：48.

［18］沈自尹.中醫(yī)腎的古今論 ［J］.中醫(yī)雜志1997，(5）：48.

［19］謝啟文，王高峰，王淑芬，等.現(xiàn)代神經(jīng)內(nèi)分泌學.上海：上海醫(yī)科大學出版社，1999：351-355.

［20］Chrousos GP，Gold PW.The concePt of stress and stress system disorder［J］.JAMM，1992，267：1244-1252.

Kidney yang deficiency constitution and hypothalamicpituitary-adrenal axis dysfunction in Lewis rats

SHOU Qi-yang1，ZHANG Li-zong1，CAI Yue-qin1，F(xiàn)ANG Peng2，NI Lin-hui2，XU Jian-qin1，SHENG Jia-Ping2，F(xiàn)ANG Ming-sun1，CHEN Min-li1
(1.Laboratory Animal Research Center，2.the Second Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University.Hangzhou 310053，China）

Objective To investigate the kidney yang deficiency constitution and hyPothalamus-Pituitary-adrenal (HPA）axis dysfunction in Lewis rats.Method Two kidney yang deficiency models were established by subcutaneous injection of hydrocortisone and by adrenalectomy to induce hyPothalamic-Pituitary-adrenal(HPA）axis dysfunction in Lewis rats.Wistar rats were used as control and comPared with the two tyPes of Lewis rat models of kidney yang deficiency.The degree of kidney yang deficiency of the Lewis rats was evaluated by examination and detection of the general signs，behavior，and neuroendocrine function，and so on.Result ComPared with the normal Wistar rats，the body weight of Lewis rats was significantly higher than that of Wistar rats at the same age.The body temPerature，urine volume and griP strength were significantly lower than those of Wistar rats(P＜0.01 for all）.The memory ability of the Lewis rats was slightly decreased.The liver，kidney and adrenal indexes were significantly decreased in the Lewis rats(P＜0.01）.Thelevels of serum ACTH，CRH，cGMP，Cort and urine 17OHCS were significantly decreased(P＜0.01）.Conclusion A very slight deficiency of adrenal cortex function of Lewis rats is caused by genetic inheritance，and Lewis rats have the constitution of congenital kidney yang deficiency(criticality or ProPhase of kidney yang deficiency）.

Lewis rat；Wistar rat；Kidney yang deficienc，HyPothalamus-Pituitary-adrenal dysfunction

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻標識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0008-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.002

浙江省公益性技術應用研究計劃(2015C37091）；國家自然科學基金項目(81202972）；浙江中醫(yī)藥大學校級科技創(chuàng)新團隊(XTD201301）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310344001）。

壽旗揚(1979-），男，副研究員，研究方向：比較醫(yī)學，E-mail：sqy133@126.com。

陳民利(1963-），女，教授，研究方向：比較醫(yī)學，E-mail：cmli991@aliyun.com。

2015-07-25