瘦素對大鼠肝纖維化的信號轉導調控及槲寄生堿的干預作用

孟 霞,王學叢,豐 平,盧 靜,王學江

（1.首都醫科大學實驗動物部，北京 100069；2.首都醫科大學病理生理教研室，北京 100069）

瘦素對大鼠肝纖維化的信號轉導調控及槲寄生堿的干預作用

孟 霞1,王學叢2,豐 平2,盧 靜1,王學江2

（1.首都醫科大學實驗動物部，北京 100069；2.首都醫科大學病理生理教研室，北京 100069）

目的 探討瘦素調控大鼠肝纖維化的信號轉導機制及槲寄生堿的干預作用。方法 以CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型為研究對象，45只大鼠隨機分為三組，分別為對照組、模型組、藥物干預組。對照組不做任何處理，自由飲食、飲水；模型組和槲寄生堿治療組分別腹腔注射40％CCl4-植物油溶液2mL/kg，每周2次，共8周。實驗第9周，治療組經灌胃給予大鼠槲寄生堿8g/（kg·d），模型組灌胃給予等劑量的生理鹽水，共8周。實驗第17周頸椎脫臼法處死所有動物，取出肝臟左前葉。采用HE染色、MASSON染色方法觀察槲寄生堿對肝纖維化大鼠肝組織形態學的影響；免疫組織化學的方法觀察槲寄生堿對大鼠肝星狀細胞瘦素及瘦素受體的影響。Western Blot法檢測大鼠肝臟組織JAK2、STAT3蛋白水平以及JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。結果 肝臟大體、HE染色以及Masson膠原染色結果提示：大鼠肝纖維化模型復制成功，槲寄生堿具有阻斷逆轉肝纖維化的作用。免疫組織化學染色顯示，與模型組比較，槲寄生堿明顯抑制模型大鼠肝組織瘦素、瘦素受體的表達。Western Blot顯示，正常對照組JAK2、STAT3蛋白表達量最少；模型組JAK2、STAT3蛋白高表達；而藥物處理組的JAK2、STAT3蛋白表達明顯下調。結論 槲寄生堿可有效逆轉大鼠肝臟纖維化，其作用機制可能是通過下調大鼠肝組織瘦素、瘦素受體的表達，進而影響JAK2/STAT3信號通路來完成的。

槲寄生堿；肝纖維化；肝星狀細胞；瘦素；瘦素受體；JAK2/STAT3信號通路

肝纖維化是由于肝損傷引起纖維增生和纖維分解不平衡，導致肝臟纖維結締組織的過度沉積所致。細胞、細胞因子及基質之間相互作用，使肝臟細胞外基質代謝紊亂，在竇周間隙過度沉積，繼之肝竇毛細血管纖維化，造成纖維在肝臟內沉積過多，最后導致肝纖維化。目前認為，肝星狀細胞激活、增殖并大量生成細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過程是肝纖維化病理機制的中心環節［1]，而瘦素（leptin）與受體結合后，激活 JAK/STAT信號通路，引起下游的轉錄因子STAT3活化后發揮效應［2]，從而促進細胞外基質的形成，促進肝纖維化的發生發展。肝纖維化目前是公認的肝癌前病變，由于肝纖維化過程是可逆的，因此對肝纖維化的治療研究已成為當今我國肝病研究領域的熱點課題。

方劑槲芪散（HQS）是國家級名老中醫錢英教授在臨床應用多年的經驗方。前期臨床觀察研究表明該方在治療慢性乙型病毒性肝炎療效顯著［3]。槲芪散的君藥是槲寄生，我們前期實驗證明，槲寄生提取物槲寄生堿具有明顯的阻斷肝癌前病變的作用［4]，而肝纖維化已明確是肝癌前病變，因此我們認為槲寄生堿可以阻斷肝癌前病變，因而對于肝纖維化也具有很好的治療效果，為觀察其作用及探討作用機制，我們進行槲寄生堿對肝纖維化發生發展干預作用的研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所需動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK（京）2011-0011】。選用6周齡，健康、雄性SD大鼠45只，體重150～165g；動物飼養于首都醫科大學實驗動物部屏障環境動物實驗室【SYXK（京）2010-0020】。

1.2 主要試劑、藥物和儀器

DMEM高糖培養基（美國Gibco公司），APES （中杉金橋），DAB（中杉金橋），DMSO（美國Sigma公司），PBS（中杉金橋），SDS（美國Sigma公司），標準胎牛血清（美國 Gibco公司），蛋白預染 Marker （美國Sigma公司），蛋白預染Marker（美國Sigma公司），其他試劑為國產分析純。中藥槲寄生（北京同仁堂），槲寄生堿由北京中醫研究所提取。

自動脫水機（LEICA ASP 300），包埋機（LEICA EG 1160），石蠟切片機（LEICA RM2125），圖象分析處理系統（Leica Qwin）。電泳裝置（美國Bio-Rad公司），電轉裝置（美國Bio-Rad公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），二氧化碳培養箱（美國Revco公司），超速低溫離心機（美國Sigma公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠肝纖維化模型復制及藥物干預

雄性SD大鼠45只，自由進食一周后進行實驗。動物隨機分成三組，分別為正常對照組、模型組、藥物干預組。正常對照組不做任何處理，常規飼養，自由飲食、飲水；模型組和藥物干預組分別進行腹腔注射40％CCl4-植物油溶液2mL/kg，每周2次，共8周，構建肝纖維化模型。8周末取一只模型組大鼠進行模型復制是否成功的鑒定。第9周開始，藥物干預組用槲寄生堿灌胃8g/（kg·d），模型對照組灌等劑量的生理鹽水，共8周。

1.3.2 肝臟標本采集

末次給藥24 h后，大鼠稱重，戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔；肉眼觀察新鮮肝臟的外形、色澤、質地等大體形態；分別在大鼠肝臟左前葉固定部位，取兩塊肝組織約（1×1×1）cm3大小，分別固定于10％中性福爾馬林溶液和苦味酸固定液，做光鏡觀察和免疫組化用。

1.3.3 病理切片的的制作及 MASSON染色、HE染色

病理切片的制作：按照常規方法，從動物體內取下新鮮肝臟，置入 Bouin氏液（飽和苦味酸 85 mL，甲醛10 mL，冰醋酸5 mL）中固定24 h后，換成70％酒精，24 h后用LEICA ASP 300自動脫水機進行脫水。完成后用自動包埋機LEICA EG 1160包埋入石蠟并切成5μm厚度的連續切片。

Masson染色：切片脫蠟（烤箱55℃），水化（二甲苯兩遍，各15 min，無水乙醇兩遍，95％乙醇，80％乙醇各5 min）。放入 Bouin氏液作用一晚（4℃）或37℃烤箱1～2 h，然后流水沖洗切片至黃色消失再進行染色；蘇木精浸染3 min，自來水洗3×3 min，氨水（自來水）返藍3 min，1％鹽酸酒精分化1～2 s，大量自來水洗10min（顯微鏡下觀察）；麗春紅酸性品紅染色7 min；蒸餾水沖洗3遍至浮色脫去；1％磷鉬酸水溶液處理3 min；不用水洗，直接用1％亮綠液復染7 min；蒸餾水沖洗3遍至浮色脫去；0.2％冰醋酸處理3遍，每遍約5 s；無水乙醇快速脫水（兩遍，共2 min），二甲苯透明（兩遍，各15 min）；中性樹膠封片。

HE染色：石蠟切片，37℃烤片2～3 h。脫蠟、蒸餾水洗滌5 min。進行蘇木素-伊紅染色，用中性樹脂，蓋玻片封片，置通風柜內晾干。顯微鏡觀察，拍照分析。

免疫組織化學染色：將肝組織切片置于60℃烤箱中烤1 h，然后二甲苯脫蠟透明2次，各10 min，100％乙醇2次，各5 min，90％ ～70％乙醇每次3 min；PBS洗3次，每次5min。進行）抗原修復（微波修復），用3％H2O2，室溫封閉5～10 min，用PBS洗3次，每次5 min，胎牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min，加一抗50μL，4度過夜，加二抗，PBS洗滌后，DAB顯色5～8 min，鏡下控制中止反應。蘇木素復染，中性樹脂封片，鏡檢。

1.3.4 Western blot免疫印記實驗

Western blot免疫印記分析聚丙烯酰胺凝膠電泳采用40 g/L濃縮膠、120g/L分離膠，上樣量30 μg，電壓80 V待蛋白跑出濃縮膠后調致100 V，電泳結束后取出凝膠，用夾心方法把濾紙，凝膠，硝酸纖維素薄膜，濾紙依順序放好，然后用海綿布、篩孔板固定好，插入電轉移槽中，并加入電轉移緩沖液，保證凝膠在陰極，硝酸纖維素薄膜在陽極方向。放入 Bio-Rad半干電轉儀中，15V電壓轉50 min左右，根據分子量的大小進行調整。用5％奶粉室溫封閉3 h以上，孵育結束后，用PBST洗膜液在搖床上劇烈搖動漂洗，3×15 min。分別加入一抗1：1000稀釋（用抗體稀釋），4℃過夜，孵育結束后，用PBS洗膜液在搖床上劇烈搖動漂洗，3×15 min。二抗1：2000稀釋（用抗體稀釋），室溫孵育1 h，孵育結束后，用PBST洗膜液在搖床上劇烈搖動漂洗，3 ×15 min。加Santa Crus發光試劑，暗室顯影并沖洗膠片，用ImageJ對條帶進行定量析。測定目的條帶的平均吸光度值，并將5次實驗結果的平均值作為蛋白含量的相對值。

1.3.5 統計分析

數值以mean±SEM表示，應用SPSS11.5統計軟件，采用t檢驗，P ＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝纖維化模型復制及藥物干預

2.1.1 肉眼觀察結果：正常對照組大鼠肝臟表面光滑，邊緣銳利，質地較軟，色暗紅，有光澤。模型組大鼠肝臟表面較正常組欠光滑，顏色均較正常組淺，邊緣鈍，質地硬，部分標本表面凹凸不平，呈小結節狀，黃褐色。藥物干預組大鼠肝臟表面較光滑，顏色較紅，無顆粒狀結節（封2圖1）。

2.1.2 光鏡下形態學變化：正常對照組肝小葉和匯管區結構正常，肝細胞呈索狀分布，無明顯肝細胞壞死，間質無擴增，膠原纖維主要分布于匯管區和中央靜脈周圍。模型組正常肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，可見肝細胞點狀壞死，炎細胞浸潤，肝細胞空泡變性散在分布，間質增生明顯，膠原纖維構成的纖維間隔形成，其破壞界板，分割、包繞肝小葉，部分動物形成較多完整的假小葉。藥物干預組肝小葉結構明顯改善，膠原纖維間隔較少，肝細胞壞死、炎性細胞浸潤少見，匯管區結締組織增生不明顯，但個別大鼠仍有不完全性假小葉（封2圖2、彩插1圖3）。

2.2 槲寄生堿對肝纖維化大鼠肝組織瘦素（leptin﹞及瘦素受體（OB-Rb﹞的影響

2.2.1 leptin的表達

正常組肝細胞內無表達，肝竇間隙、匯管區基質及間質細胞內有極少量表達。模型組肝內leptin的表達明顯增強，主要見于肝星狀細胞中。纖維間隔有弱陽性表達。陽性物質主要集中在胞質內，胞膜上有少量表達。藥物治療組陽性染色程度較模型組明顯減輕，主要表達集中在肝星狀細胞中（彩插1圖4）。

2.2.2 0B-Rb表達

正常肝組織不表達或僅微弱表達于門靜脈、小葉中央靜脈周圍細胞及匯管區的結締組織，著色淺淡；模型組匯管區周圍細胞、門靜脈及中央靜脈周圍細胞和纖維間隔內均見OB-Rb陽性著色細胞，且著色明顯增強，主要見于非實質細胞（包括肝星狀細胞、竇內皮細胞、枯否細胞等）胞質及胞膜上，部分可定位于胞核；藥物治療組陽性染色程度較模型組明顯減輕，主要表達集中在肝星狀細胞中（彩插2圖5）。

2.3 槲寄生堿對肝纖維化大鼠肝組織 JAK2/STAT3信號轉導通路的影響

用Western Blot法檢測肝臟組織內 JAK2、STAT3表達情況，兩種總蛋白三組之間表達比較均一；檢測肝臟組織內P-JAK2、P-STAT3表達情況，正常組蛋白表達量最少，各藥物處理組蛋白條帶顏色均較淺，模型組條帶顏色最深。與正常組比較，模型組P-JAK2、P-STAT3蛋白程度均增高，差異有顯著統計學意義（P ＜0.01）；與模型組相比，藥物治療組的P-JAK2、P-STAT3蛋白表達顯著降低，差異具有統計學意義（P ＜0.01）（圖6）。

圖6 大鼠肝臟組織內JAK2和STAT3Western blot結果Note：A.Normal group，B.Model group，C.Therapeutic group.Data are presented asmean±SEM of three independent experiments.***P＜0.01 vs.normal group；###P＜0.01 vs.model group.Fig.6 Expression of JAK2/STAT3 protein in liver tissue detected by western blot

3 討論

肝纖維化發生的機制至今尚未完全清楚。目前認為，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活、增殖并大量生成ECM的過程是肝纖維化病理機制的中心環節［5]。肝纖維化過程中，啟動HSC增殖及使其持續的因素尚未完全闡明。最近有文獻［1]報導枯否細胞也與肝纖維化有密切的關系。己知HSC的激活和增殖受多種細胞因子（cytokines，CK）的調控［6-7]。

瘦素（leptin）是新發現的促肝纖維化的細胞因子，大量的臨床與實驗研究顯示，瘦素與肝纖維化的形成之間有著密切聯系。在慢性病毒性肝炎、酒精性肝硬化、原發性膽汁性肝硬化等患者中均可見血清瘦素水平明顯升高［8]。瘦素與OB-Rb相結合激活HSC內相應的信號分子，在某些轉錄因子的作用下，轉導信號入核，促進相關靶基因的轉錄和表達，從而進一步活化HSC，使其增殖、并轉化為肌樣成纖維細胞（myofibrosblast，MFB），合成、分泌大量細胞外基質（ECM）［9]。有研究表明，HSC內瘦素受體后信號轉導途徑可能涉及到JAK-STAT途徑，另外，活化的JAK激酶可激活Ras-Raf-MEK-MAPK、PI3K/AKT等其他信號轉導途徑。而在肝纖維化中，瘦素的信號轉導機制主要與 JAK2［10]與STAT3［11]磷酸化有關，但不完全依賴該通路。

目前推測leptin介導的JAK-STAT信號轉導途徑可能是：leptin與其受體結合后則可誘導受體形成同源或異源二聚體，吸引非受體型酪氨酸激酶JAK2。JAK2能磷酸化OB-Rb上的酪氨酸位點（即酪氨酸Tyr殘基磷酸化，Tyr-P），使OB-Rb上產生了與STAT3結合的區域。STAT3在沒有特異性的刺激時定位于胞質內，當細胞受到刺激時，STAT3上的SH2結構域與OB-Rb上被磷酸化的酪氨酸殘基結合，同時自身被 JAK2磷酸化。兩個磷酸化的STAT3分子可通過Tyr-P和SH2域形成二聚體，結合在靶基因上游的反向重復序列上，啟動特定基因的表達、轉錄并翻譯特定蛋白質，迅速提高目的基因的轉錄效率，活化HSC促進肝纖維化的發展等疾病發生［12]，從而發揮leptin的生物學功能。此外有人證明leptin可從其他信號轉導途徑發揮其生物學功能［13]。

本實驗首先通過體內實驗探討瘦素和肝纖維化的關系，免疫組織化學實驗結果顯示，模型組大鼠瘦素和瘦素受體的表達量明顯增高，而且其下游的信號通路JAK2/STAT3蛋白磷酸化的水平明顯提高，這說明瘦素確實與肝纖維化密切相關，并且是通過與功能受體結合，從而激活下游JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化而發揮致纖維化作用的。

我們實驗室前期的實驗證明槲芪散在治療肝纖維化，使調節能量代謝的酶類基本維持在正常水平，保護實驗性肝損傷，抑制/逆轉肝癌前病變方面療效顯著［14]，并可干預肝纖維化的發生發展。其君藥槲寄生性平、味苦，具有強筋骨、安胎、祛風濕、益血、補肝腎等功能。近年來，槲寄生的抗癌作用受到國內外醫藥學界的廣泛重視［15-16]，并且已從多種槲寄生植物中提取到具有抗癌活性的凝集素，毒肽，植物糖蛋白和生物堿。我們前期研究證實，槲寄生堿具有明顯阻斷肝癌前病變的作用，而肝纖維化已明確是肝癌前病變，因此我們認為槲寄生堿可以阻斷肝癌前病變，因而對于肝纖維化也具有很好的治療效果，為探討其發生機制，我們進行研究。實驗結果顯示，槲寄生堿治療組肝臟大體和光鏡下結果都明顯好于模型組，治療組免疫組化和Western Blot結果顯示，瘦素，瘦素受體，JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化水平都較模型組低，這都說明槲寄生堿對肝纖維化有很好的治療效果，且是通過抑制瘦素，瘦素受體，JAK2/STAT3信號通路蛋白磷酸化這一機制而實現的。

綜上所述，CCl4引起肝損傷發生時，觸發HSC活化并大量表達瘦素，其后瘦素作用于OB-Rb，激活其JAK-STAT信號轉導途徑，促進竇內皮細胞等表達TGF-pl，并在其介導下進一步誘導HSC的增殖、活化，進而促進膠原（尤其是I型膠原）等ECM的合成和分泌，如此循環反復，最終促進了肝纖維化的發生、發展。槲寄生堿可有效逆轉大鼠肝臟纖維化，其作用機制可能是通過下調大鼠肝組織瘦素、瘦素受體的表達，進而影響JAK2/STAT3信號通路來完成的。槲寄生堿能干預瘦素在肝星狀細胞內的信號轉導，致肝星狀細胞JAK2、STAT3蛋白低表達，這可能是其抗肝纖維化的機制之一。

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學術不端行為是指違反學術規范、學術道德的行為，國際上一般用來指捏造數據（fabrication）、竄改數據（falsification）和剽竊（plagiarism）三種行為。但是一稿多投、侵占學術成果、偽造學術履歷等行為也可包括進去。學術不端行為在世界各國、各個歷史時期都曾經發生過，但是像中國當前這樣如此泛濫，嚴重到被稱為學術腐敗的地步，卻是罕見的。這不僅表現在違反者眾多、發生頻繁，各個科研機構都時有發現，而且表現在涉及了從院士、教授、副教授、講師到研究生、本科生的各個層面。由于目前中國缺乏學術規范、學術道德方面的教育，科技工作者在學習、研究過程中發生不端行為，經常是由于對學術規范、學術道德缺乏了解，認識不足造成的。因此，對科技工作者進行學術規范、學術道德教育，防患于未然，是遏制學術腐敗、保證中國學術研究能夠健康發展的一個重要措施。

早在2007年，中國科協就發布了科技工作者科學道德規范，本刊重溫此規范，以期在我刊營造一種健康的學術研究氛圍，由于版面限制，我刊陸續將規范全文刊出。

The signal transduction pathway of rats w ith liver fibrosis regulated by leptin and interfering effects ofm istletoe alkali

MENG Xia1，WANG Xue-cong2，FENG Ping2，LU Jing1，WANG Xue-jiang2
（1.Department of experimental animals，Capital Medical University，Beijing 100069，China；
2.Department of pathophysiology，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To investigate the signal transduction pathway mechanisms of rats with liver fibrosis regulated by leptin and interfering effects ofmistletoe alkali.Methods The hepatic fibrosis in ratsmodelwas established by injecting carbon tetrachloride.Forty-five SD ratswere randomly divided into normal group，model group and therapeutic group.All rats except rats in normal group were intraperitoneally injected with 40％carbon tetrachloride in peanut oilwith a dose of 2.0 mL/100g according to the body weight twice a week for 8 weeks.Then，the therapeutic group was givenmistletoe alkali（8g/（kg·d））for 8 weeks via gastrogavage.Rats in normal and model group were served with distilled water at the same time.At the end of the 16th week，blood and tissue specimens were taken from all the rats.The influence ofmistletoe alkalion livermorphology in liver fibrosis ratmodel was reviewed by HE and Masson staining.The effects of mistletoe alkali on the expression of Leptin and its receptor（OB-Rb）in HSC in fibrosis rat model were determined by immunohistochemistry（IH）.The expression of JAK2，STAT3 and the activity of phospho-JAK2，phospho -STAT3 were detected by Western blotting analysis.Results The degree of fibrosis of themodel group wasmore severe than the normal group and the treatment group，which suggested thatmistletoe alkali can reverse liver fibrosis in rats.Immunohistochemical staining showed thatmistletoe alkali reduced the hepatic expression of leptin and OB-Rb in ratswith liver fibrosis in comparison with their expression in themodel group.Compared with the normal group，the expression of JAK2 and STAT3 increased in themodel group.However，the expression of JAK2 and STAT3 decreased in themedication groups compared with the model group.Conclusion Mistletoe alkali can effectively ameliorate liver fibrosis in rats possibly through inhibiting hepatic leptin and its receptor expressions，which through inhibiting hepatic leptin and its receptor expressions，thus inhibit the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Mistletoe alkali；Liver fibrosis；Hepatic stellate cells；Leptin；OB-Rb；JAK2/STAT3 signaling pathway

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.001

國家自然科學基金資助項目（81272757）；北京市屬高等學校創新團隊建設與教師職業發展計劃項目（IDHT20150502）。

孟霞（1973-），女，主管技師，研究方向：動物實驗及實驗動物管理，E-mail：mengxia@ccmu.edu.cn。

盧 靜（1969-），女，副教授，研究方向：實驗動物模型研究，E-mail：lijing@ccmu.edu.cn；王學江（1957-），女，教授，研究方向：病理生理學研究，E-mail：xjwang@ccmu.edu.cn。

﹞2015-08-19