放射耐受性人小細胞肺癌亞株的建立

劉 靜,田海梅,李艷芬,李 茉,王小兵,張 偉

（中國醫學科學院腫瘤醫院生物檢測中心，北京 100021）

放射耐受性人小細胞肺癌亞株的建立

劉 靜,田海梅,李艷芬,李 茉,王小兵,張 偉

（中國醫學科學院腫瘤醫院生物檢測中心，北京 100021）

目的 建立肺癌NCI-H446細胞放射抗拒性亞株，為小細胞肺癌放射抗拒和逆轉研究提供配對的細胞研究工具。方法 通過梯度照射NCI-H446細胞株誘導其耐放射性（共7500cGy），并通過檢測細胞總的ATP含量的方法來監測細胞倍增時間，流式細胞儀檢測細胞周期分布，以及應用多靶單擊模型SF=1-（1-e-D/D0）N擬合細胞存活曲線分析其放射敏感參數的變化。結果 比較親本與耐放射株的差異，放射生物學參數值分別為D0（1.9673，2.2756）、N（1.0016，2.6008）、Dq（0.6783，1.6860）、SF2（0.3623，0.7134），耐放射株SF2值為親本的1.97倍，G2/M期細胞所占比由18.52％下降到7.84％。耐放射株的細胞形態發生變化，倍增時間比敏感株延長。結論 通過梯度照射建立了小細胞肺癌NCI-H446的耐放射亞株NCI-H446-R，與親本細胞相比放射生物學參數有顯著差異（P＜0.05），本研究成果為研究小細胞肺癌放射抗拒及耐放射逆轉提供了新的細胞模型。

放射抗拒；小細胞肺癌；NCI-H446細胞株；細胞周期

由于環境污染日益加劇、吸煙等原因，肺癌已持續成為世界范圍內最常見的惡性腫瘤，且發病率仍呈上升趨勢，據《2012中國腫瘤登記年報》發布，從全國來看，肺癌居惡性腫瘤發病的第一位，每10萬人約有 54人會患肺癌，占惡性發病率的18.74％，男性為女性的1.94倍［1]，極大威脅著人類的健康和生命。肺癌的病理類型中小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占肺癌發病總數的20％～25％。由于SCLC細胞倍增時間短、進展快，與其他腫瘤不同之處就是早期即傾向于遠處轉移，主要采取以放化療為主的綜合治療［2]。然而，部分SCLC患者對放療不敏感，放療后易出現復發，腫瘤細胞對放射線抗拒是影響SCLC放療效果的主要因素。

SCLC的放療抗拒研究對提高肺癌的預后具有重要價值，國內已有分子和細胞水平的研究報道，但不足之處是細胞研究模型不統一且來源各不相同，尤為關鍵的是尚未穩定成株的肺癌細胞株并缺乏必要的參數鑒定。本研究選擇來自 ATCC （american type culture collection）的小細胞肺癌NCIH446細胞株作為親本細胞系，體外通過序貫輻射誘導的方法，誘導獲得具有放射抗拒性的細胞亞株NCI-H446-R并穩定傳代。同時，研究和摸索建立耐放射細胞系的實驗方法，為其他耐放射細胞系的建立提供依據。

1 材料和方法

1.1 輻射誘導

應用醫用電子直線加速器（X射線），品牌：Clinac 600C/D（由中國醫學科學院腫瘤醫院加速器室提供使用），由低劑量到高劑量按照2Gy、5Gy、8Gy、10Gy的順序逐漸增加放射劑量，一次照射完成細胞恢復狀態后，繼續下一次照射。照射次數共12次，照射總劑量7500cGy，分別為：（2Gy×3次，5Gy ×3次，8Gy×3次，10Gy×3次），劑量率300cGy/min，射野大小：10 cm×10 cm，細胞瓶表面覆有約1.5 cm厚的補償膜，照射后4 h換新鮮培養液。

1.2 細胞培養

NCI-H446細胞株來自ATCC，由本中心常規保存。 采 用 10％ FBS（Hyclone SH30084.03），RPMI1640（Gibco 31800105）培養基，37℃、5％CO2培養箱（Forma Model3111）中培養。照射后根據細胞密度傳代，細胞狀態穩定后繼續下一次照射，照射前凍存部分細胞保種。

1.3 單克隆篩選細胞亞株

按照計劃的放射劑量完成照射后，采用單克隆方法得到耐放射性及生長特性趨于統一的細胞，從而純化細胞株。取對數生長期的細胞，0.25％胰酶消化成單個細胞后接種到96孔板上。每日觀察克隆的形成情況，克隆形成后，顯微鏡觀察標記出單克隆的孔，消化取出細胞并繼續擴大培養，分別標記其亞株名稱。選擇生長狀況良好的一個亞株并穩定傳代30次以上，命名為NCI-H446-R。

1.4 放射敏感參數測定

通過經典的克隆形成實驗，來檢驗NCI-H446-R的耐放射性。取對數生長期的NCI-H446與NCIH446-R細胞，胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞后，將細胞懸浮在含10％FBS的RPMI1640培養液中備用。細胞懸液按倍數稀釋后，每種細胞設三個平行孔2 mL/孔，在標記為（0Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy）的不同12孔板中分別按600個/孔、1000個/孔、4000個/孔、8000個/孔和10000個/孔接種細胞，并輕輕轉動使細胞分散均勻，4 h后按所標記劑量完成照射。照射后在37℃、5％CO2飽和濕度的培養箱中靜置培養2周左右。當形成克隆的面積足夠大（單克隆細胞數＞50個細胞）且克隆間不相連時終止培養。棄上清并用PBS小心浸洗2次。加甲醇2 mL，固定15 min，去固定液，加適量Giemsa染色10 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將12孔板置于顯微鏡下，統計形成的克隆數并計算得出存活分數值，實驗重復一次。最后應用多靶單擊模型繪制細胞存活曲線。

1.5 細胞周期測定

誘導的耐放射株經最后一次10Gy照射后，調整細胞狀態最終穩定傳代成NCI-H446-R細胞株。取對數生長期的敏感株與耐放射株細胞，胰酶消化制成單細胞懸液并計數，每種取約1×106個細胞離心去培養基，加75％冰乙醇固定，置于-20℃過夜。次日離心棄上清，PBS洗2次后加PI染色，經流式細胞儀（flow cytometry，FCM）檢測兩種細胞的細胞周期分部。最后，通過ModFit LT軟件繪制細胞周期分部圖，對比親本株和耐放射株的細胞周期變化情況。

1.6 ATP法繪制細胞生長曲線

取對數生長期的敏感株與耐放射細胞株，消化細胞成單個后計數，調整細胞密度為2000個/mL。設8個平行孔，加200 uL/孔細胞懸液，每種細胞株分別接種8塊96孔板，每塊培養板分別標注對應的細胞株名稱及第1天～第8天，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養箱中培養。通過檢測每個孔中總的細胞內三磷酸腺苷（ATP）含量的方法（試劑盒購于：北京金紫晶生物醫藥技術有限公司），來觀察細胞的增殖情況。每24 h檢測一對培養板，連續測8 d，繪制細胞生長曲線。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 放射生物學參數

2.2 細胞周期變化

通過流式細胞儀測得的數據顯示，NCI-H446-R與NCI-H446在細胞周期分布上存在顯著差異（彩插7圖2）。對比兩株細胞的細胞周期所占比例，NCI-H446-R的G1期與S期細胞所占比例分別由63.52±8.25％和17.96±2.93％上升到67.94± 6.02％和24.23±2.26％；G2/M期細胞由18.52± 3.14％下降到7.84±2.19％，結果顯示耐放射細胞株G1期和S期比例增多，G2/M期比例減少。

2.3 細胞生長差異

細胞在射線照射馴化過程中，會出現大片死亡脫落，鏡下觀察可見不同程度的細胞變形增大、多偽足，細胞內外顆粒較多，細胞內出現大量空泡、核變大及多核等特征。隨著照射劑量的不斷加大，細胞恢復狀態的時間也隨之加長。通過ATP法檢測并繪制細胞生長曲線（彩插7圖3），NCI-H446約在第2天進入對數生長期，第6天進入平臺期；NCIH446-R在第3天進入對數生長期，第8天進入平臺期。耐放射株的倍增時間較敏感株延長。在相同的培養條件下，NCI-H446-R的細胞形態較其親本株也有所不同。

圖1 多靶單擊擬合模型擬合的NCI-H446＆NCIH446-R細胞存活曲線

3 討論

目前國內外相關研究者已經通過不同的誘導方法建立起多種不同組織來源的耐放射細胞亞株［3-5]，并對獲得的耐放射細胞進行了系統的耐放射性分析。對于細胞耐放射性的產生機制主要有兩種不同的觀點。首先，有觀點認為同一細胞群中即使是同一來源的細胞也存在著放射敏感性不同的細胞亞群。即使是同一細胞來源的腫瘤細胞，在內外環境的不斷作用下，對放射線的敏感程度也存在差異，放射線選擇性的殺死了放射敏感的細胞，使放射抗拒的細胞存活下來并不斷增殖，并使其后代也具有了耐放射性；另外，有學者認為，在照射過程中雖然殺死了大部分的腫瘤細胞，但同時也誘導了部分細胞突變，使其具有耐放射性并不斷增殖［6]。總之，放射線照射后存活的細胞具有了輻射耐受性，它和親本細胞是具有同一來源放射敏感性不用的細胞株。

本研究采用多次照射、逐步增加放射劑量的方法誘導出耐放射性較高的細胞亞株，總的照射劑量為7500cGy。從細胞株的初次誘導，到細胞穩定傳代后完成耐放射性鑒定，歷時16個月。設定的照射劑量完成后，通過亞克隆實驗純化出單克隆株，使其生物特性更趨于一致。最后通過經典的克隆形成實驗來檢測并計算其放射生物學參數：終斜率D0值、準閾劑量 Dq值、外推值 N和 SF2。計算得出，NCI-H446-R的SF2值為其親本株的1.97倍，有顯著差異（P ＜0.05）性。不同細胞周期對放射的敏感性也不同，一般S期的細胞最抗拒，G2/M期對放射線最敏感［7]。通過流式細胞儀檢測，NCI-H446-R的G2/M期所占比例為7.84％，親本株為18.52％，存在顯著差異（P ＜0.05）。輻射損傷主要表現為細胞再增值能力的喪失，細胞經放射線照射后的1～2代之內細胞并未有明顯變化，待傳至2～3代后細胞會出現大片死亡、脫落，發生有絲分裂性死亡，失去腫瘤的無限增值能力。存活的細胞在形態上會出現顯著的變化，細胞核質比增大，雙核；細胞內顆粒物增多，多空泡；生長速度變慢，代謝加快；細胞個體間形態差異較大，多偽足。傳至8～10代以后，細胞形態逐漸恢復，趨于統一，增殖速度和代謝水平也逐漸恢復。最終誘導出的耐放射細胞株NCI-H446-R，較敏感株在細胞形態和倍增時間上也有所不同，在某種程度上也驗證了細胞周期的檢測結果。

總之，本研究通過梯度照射法，模擬臨床上耐放射細胞的形成過程，建立了小細胞肺癌細胞株NCI-H446的放射抗拒性細胞亞株NCI-H446-R并穩定傳代，通過克隆形成等實驗驗證了其耐放射性［9-10]。在未來的工作中，我們將進一步利用獲得的放射抗拒細胞株，來開展有關小細胞肺癌放射抗拒及耐放射逆轉等相關研究。

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The establishment of a radiation-resistant small cell lung cancer subline

LIU Jing，TIAN Hai-mei，LIYan-fen，LIMo，WANG Xiao-bing，ZHANGWei
（Tumor Marker Research Center，Cancer Institute＆Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021，China）

Objective To establish a radiation-resistant cell subline from a human small cell lung cancer（SCLC）cell line NCI-H446，providing a pairing research tool for investigating mechanism of radiation tolerance and the reverse strategy in lung cancer.Methods The NCI-H446 cell was radiated repeatedly by increased dose of radiation gradually （total7500cGy）and a radiation-resistant cell substrain was induced and selected from the survival of cells.The doubling time and cell cycle distribution of the substrain were detected by ATP kit and flow cytometry Assay respectively；Radiation biology parameters were calculated and analyzed by cell survival curve fitting from multi-targetmodel，SF=1-（1-e-D/D0）N.Results Comparing with the control，The resistant substrain radiobiology parameter values were D0（1.9673，2.2756），N（1.0016，2.6008），Dq（0.6783，1.6860）and SF2（0.3623，0.7134）respectively.Cellmorphology ismore slender and hasmore tentacles.The SF2value of radiation-resistant subline is 1.97 timesmore than that ofwild cell line.The proportion of radiation-resistant cells in G2/M-phase was down to 7.84％，compared with the 18.52％ofwild cells.Conclusions A radiation-resistant SCLC subline NCI-H446-R is established andmay be a useful tool for studying resistant to radiation of SCLC in the future.

Radiation resistance；Small cell lung cancer；NCI-H446 cell line；Cell cycle

張偉（1964-），男，研究員，研究方向：主要從事轉化醫學研究。E-mail：zhangww1954@126.com。

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0051-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.012

劉靜（1984-），女，研究實習員，研究方向：腫瘤細胞相關實驗研究。E-mail：liujingcicams@163.com。

﹞2015-08-18

研究報告