SD大鼠標本血量不足對凝血四項檢測結果的影響

翟青新,黃愛軍,錢麗萍

（1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心，南京 210008；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院醫學檢驗科，南京 210008）

SD大鼠標本血量不足對凝血四項檢測結果的影響

翟青新1,黃愛軍2,錢麗萍1

（1.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心，南京 210008；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院醫學檢驗科，南京 210008）

目的 探討大鼠的最佳抗凝比，分析標本血量不足對凝血四項檢測結果的影響。方法 60只大鼠分成2組，按真空采血法采集空腹12 h腹主動脈血液。第一組20只，用于全血細胞測定。全自動血液細胞計數儀檢測紅細胞壓積（hematocrit，HCT），血小板計數（platelet，PLT）。第二組40只，每只鼠采2管血，按抗凝比［枸櫞酸鈉抗凝劑與全血的比例（V∶V）]分成1∶9（對照組）及1∶5（實驗組），1∶8（實驗組）及1∶7（實驗組），離心獲乏血小板血漿。全自動血凝分析儀檢測凝血四項：凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplatin time，APTT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（Fibrinogen，FIB）。結果 SD大鼠HCT（％）為41.7±2.9，PLT（×109/L）為1114±173。隨著抗凝比的增大，PT、APTT、TT延長，FIB減小。與對照組相比：1∶8實驗組，差異無統計學意義。1∶7實驗組，除TT差異有統計學意義外，另3項指標差異無統計學意義。1∶5實驗組，差異有統計學意義。結論 凝血四項的結果受抗凝比的影響。1∶9是大鼠最佳抗凝比，1∶8尚可。大鼠有其獨特的生理特性。為大鼠的相關研究提供了基礎的科學數據和基本的理論依據。

大鼠；凝血四項；紅細胞壓積；血小板計數

正常的止血機制有賴于血管壁內皮細胞、血小板、凝血系統、抗凝系統、纖維蛋白溶解系統、以及血液流變學等結構與功能的完整性以及它們之間的生理性調節與平衡［1]。據國家衛生和計劃生育委員會衛醫發［2000]412號文件《出血時間、凝血時間檢驗方法操作規程的通知》，動物實驗中凝血四項的檢測逐步興起。該檢測主要用于動物外科術前凝血功能的檢查、肝病動物模型肝功能的判斷以及中藥對凝血功能的影響。血液離體即開始變化，凝血因子的消耗或激活會導致檢測結果的異常，故對標本要求特殊、嚴格，只有合格標本的檢測結果方有意義。特別強調：人血的抗凝比必須為1∶9，抗凝比的改變直接影響檢測結果的準確性和可靠性［2-4]。

大鼠實驗經常依靠處死前的唯一一次大量采血，實際科研工作中，經常由于采血困難，遇到抗凝比大于1∶9的標本。故本文主要針對標本血量不足對凝血四項的影響進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠，體重300～320 g，60只，來源于上海杰思捷實驗動物有限公司【SCXK（滬）2013-0006】。飼養和實驗在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院動物實驗中心屏障環境內進行【SYXK（蘇）2014-0052】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要器械和耗材

大鼠固定板（含橡皮筋），解剖剪，血管鉗等常規手術器械，砂輪，棉簽、棉球、紗布、2 mL注射器少許。碧迪（BD）醫療器械有限公司產品：一次性使用真空采血針組件（規格：0.8×20 mm×180 mm）；一次性使用真空靜脈血樣采集容器（以下簡稱“紫頭管”），規格型號：K2EDTA，2 mL；一次性使用人體靜脈血樣采集容器（以下簡稱“淺藍頭管”），規格型號：枸櫞酸鈉管，2.7 mL。

1.3 主要儀器和試劑

電子天平（精確到1 g，上海天平儀器廠），XS-800i全自動血液分析儀（日本Sysmex公司），離心機（52A型醫用低速離心機，河北省安新縣白洋離心機廠制造），CA-7000全自動血凝分析儀（日本Sysmex公司），試劑、校準物和質控品及一次性反應杯等均為該儀器原裝進口配套產品。

1.4 方法

60只大鼠隨機分成2組：第一組20只，采血測HCT、PLT。第二組40只，采血測凝血四項。適應性飼養1周后，禁食12 h，自由飲水。稱重，10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g體重），仰臥固定，開腹，真空采血法用采血針組件和相應的采血管從腹主動脈采血。

第一組，紫頭管采血后立即輕輕顛倒180°露底混勻8～10次，使血液與抗凝劑充分混勻，動作要及時、輕柔、到位。頭蓋向上在室溫下放置。淘汰有血凝塊的標本。測定HCT，PLT，2 h內檢測完畢。第二組，梯度標記60個淺藍頭管：因管內有0.3 mL液態枸櫞酸鈉抗凝劑，從抗凝劑液面到刻度線為2.7 mL（抗凝比為1∶9），故在管外壁用Mark筆標出相應刻度，使抗凝比為1∶5、1∶7、1∶8。每只大鼠取2個梯度抗凝比的血液，采集方法同上。3000 r/min［5]離心15 min，目測各管血細胞比容（HCT），淘汰重度溶血標本。分離血漿，務必去除血小板。測定合格標本的凝血四項，2 h內檢測完畢。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 第一組，順利采樣并檢測

HCT（％）、（PLT×109/L）的檢測結果分別為41.7 ±2.9和1114±173。

2.2 第二組，順利采樣并檢測

凝血四項的檢測結果見表1。

表1 SD大鼠不同抗凝比例血漿凝血四項測定值（n=20）Tab.1 Values of coagulation test of diffent anticoagulant ratio plasmas（n=20）

2.3 SD大鼠HCT、PLT及凝血四項測定值與人類比較［6］

與人類相似的是：Hct分別為41.7％和38.0～50.8％。高于人類的是：PLT分別為1114×109/L和100～300×109/L。TT分別為39s和13～21s。

3 討論

動物實驗常需要通過血液標本獲得數據。《禮記》載“君子慎始，差若毫厘，謬以千里”，要想得到“真值”，必須對所有影響因素要有系統全面的認識，樹立全過程質量控制理念，動物自身因素有來源、品種、品系、日齡、性別、微生物等級和飼養環境；人為因素有血液采集方法［應激和麻醉劑、采血部位、采血時間、血液體積、抗凝劑]、貯存方法、測定方法和所采用的儀器和試劑。檢驗分析前質量控制是廣大動物實驗科研人員最容易忽略的環節之一。

在用檢測人類的儀器檢測動物前，有必要先咨詢儀器工程師［7]，了解儀器項目設定的線性范圍并加以調整，確保標本數據完整。溝通好檢測事宜，合理安排實驗。采集血液后及時送檢和檢測。

仔細閱讀所有耗材說明書，掌握真空采血原理、注意事項且熟練步驟［8]。真空采血管不同品牌品質不一，對分析結果有一定干擾［9-10]。淺藍頭管保質期只有8個月，不用過期管，防止管內霉變，防止真空泄漏。

因血液黏稠度或血脂高［11]，血液容易凝集，故大鼠應空腹，且通過麻醉使其平靜。盡管全血細胞檢測不需要空腹，但動物實驗往往一次采血進行多個項目的檢測，而大多數項目都需要空腹，故本實驗取空腹血測HCT和PLT［12]，更接近科研實際。

人血凝血四項檢測抗凝比必須為1∶9的原因如下：抗凝劑與血的比例是基于“HCT（％）為（45± 5）％，即血漿為（55±5）％”這一基礎，實質是“抗凝劑與血漿的比例為1∶5（抗凝劑0.3 mL，血漿1.5 mL）”。HCT（％）小于20或大于50時（低于或超出正常范圍時），應按照下面公式調整抗凝劑用量：抗凝劑用量（mL）=0.00185×全血量（mL）×［100-HCT（％）]。抗凝劑濃度推薦為109 mmol/L，以保證抗凝劑在血漿中的絕對含量不變，血漿中各凝血因子的量越接近于動物生理值，凝血試驗結果就越能反映各凝血因子質與量的真實水平［4]。故本實驗測了HCT，以推斷大鼠血的最佳抗凝比。

除抗凝比外，此檢測分析前質控主要包括：防止凝塊（特別是肉眼不可見的微小凝塊）、原始標本（未離心）室溫放置時間不超過2 h、血漿標本4℃冰箱放置時間不超過4 h、無重度溶血。這些因素對結果的影響，各文獻報道略有不同［13-15]，大致可以解釋如下：凝塊消耗凝血因子，使PT、APTT、TT延長、FIB降低；CA-7000凝血儀具有強大的抗干擾能力，血漿內Hb≤4.8 g/L時，溶血對PT、APTT沒有影響，但對TT有影響［16]。冷藏或低溫保存（原始標本）會損傷血小板，活化部分凝血因子Ⅶ、Ⅺ，使PT、APTT縮短，故原始標本需在室溫下運送，但易變凝血因子Ⅷ及V因子對熱不穩定，若室溫下放置超過2 h，隨著溫度升高和放置時間延長凝血因子活性逐漸喪失，使PT、APTT延長，TT縮短。故在做科研之前，有必要了解這些影響因素，統一操作，使數據統計更有意義。

本實驗考慮到采血的可操作性，采集研究的是大鼠動脈血。靜脈血或許有不同，但不影響科研與臨床實際。從分析前質控角度，研究了大鼠的HCT、PLT及凝血四項，把實驗動物的基礎數據研究提高了一個層次。為給對人類血液數據耳熟能詳的臨床醫生及廣大醫務科技工作者提供生動參考，把大鼠數據與人類進行了簡單的比較。初步得出：大鼠PLT比人高很多，值得進一步探討。大鼠HCT在（45±5）％且接近下限，理論上抗凝比1∶9也是最佳比例。TT比人高很多，與已報道的文獻［17-18]結論一致。

綜上所述，1∶9是大鼠凝血四項最佳抗凝比。凝血四項的結果受抗凝比的影響。當標本抗凝比介于1∶8與1∶9之間時，可以用于凝血檢測，謹給科研及獸醫臨床實際提供參考。

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Influence of insufficient blood specimens volume on the detection results of coagulation tests in SD rats

ZHAIQing-xin1，HUANG Ai-jun2，QIAN Li-ping1
（1.Center of Animal Experiments，Nanjing Drum Tower Hospital，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medicine School，Nanjing 210008，China；2.Department of Clinical Laboratory，Nanjing Drum Tower Hospital，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medicine School，Nanjing 210008，China）

Objective To explore the best anticoagulant ratio in SD rats.To analyse the influence of insufficient blood specimens volume on coagulation tests.M ethods 60 rats were divided into 2 groups.According to themethod of vacuum blood，collect abdominal aortic blood after fasting12 hours.The firstgroup 20 ratswere used only for routine blood test.Fully automatic hematology analyzer detected hematocrit and platelet.The second group 40 rats were used for coagulation test.Every rat was collected 2 blood specimens with different anticoagulant ratio［the proportion of sodium citrate anticoagulation and thewhole blood（vlume∶volume）]1∶9（the control group）and 1∶5（the experimental group），1∶8（the experimental group）and 1∶7（the experimental group）.Get plasma without platelet through centrifugation.Fully automatic blood coagulation analyzer detected prothrombin time，activated partial thromboplatin time，thrombin time and Fibrinogen.Results HCT（％）and PLT（x 109/L）in SD rats were respectively 41.7±2.9 and 1114±173.Asanticoagulant ratio was increased，PT，APTT and TT were extended and FIB was decreased.Compared with the control group，these PT，APTT，TT，FIB four results of 1∶8 group were not statistically different，of 1∶5 group were statistically different，these PT，APTT，FIB three results of 1∶7 group were not statistically different，TT of 1∶7 group was statistically different.Conclusions The detection of coagulation project coagulation test results were affected by the proportion of anticoagulant and blood.1∶9 was the best anticoagulant ratio in SD rats，1∶8 can also.Rat had its unique physiological characteristics.The results could provide reference for the evaluation of rats.

Rat；Coagulation test；Hematocrit；Platelet

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0042-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.010

翟青新（1973-），女，碩士，高級獸醫師，研究方向：實驗動物飼養與科研管理。E-mail：1508505619@qq.com。

﹞2015-08-18

研究報告