斑馬魚uba6和uba7突變體的構建與鑒定

丁慧美,阮 華,黃紅輝

（淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，西南大學生命科學學院，重慶 400715）

斑馬魚uba6和uba7突變體的構建與鑒定

丁慧美,阮 華,黃紅輝

（淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，三峽庫區生態環境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，西南大學生命科學學院，重慶 400715）

目的 構建斑馬魚uba6和uba7突變體。方法 運用TALEN技術在斑馬魚uba6和uba7基因編碼區引進突變，并測序鑒定突變類型。結果 成功獲得了兩種突變類型的uba6和三種突變類型的uba7斑馬魚突變體。結論 成功構建了斑馬魚uba6和uba7突變體，為進一步研究斑馬魚uba6和uba7基因的功能提供了材料。

斑馬魚；uba6基因；uba7基因；TALEN

TALEN （transcription activator-like （TAL）effector nucleases）是一種新型的靶向基因編輯技術，現已應用于細胞、酵母、植物、斑馬魚及大、小鼠等各類研究對象。其原理是利用植物細菌Xanthomonas sp.TALE蛋白核酸結合域的氨基酸序列可對應識別結合位點的核酸，組裝Xanthomonas sp.TALE的氨基酸序列模塊識別特定DNA序列，并與核酸酶重組融合，這一人工構建的核酸酶可在特定位點識別（通過TALE氨基酸序列模塊執行）并剪切（通過核酸酶執行）目的基因DNA序列，斷裂的DNA在修復過程中會引進小片段插入或缺失，導致基因突變［7-8]。

斑馬魚是研究脊椎動物發育的理想模式動物，其基因組與人類高度同源。小鼠中UBA6和UBA7基因功能已有一定的研究［4，6]，但在斑馬魚中這兩個基因的功能尚不可知，運用反向遺傳學手段在斑馬魚中建立突變體有助于研究其功能。本文應用TALEN技術對斑馬魚中uba6和uba7基因進行編輯，通過篩選獲得可遺傳的突變體，為后續進一步探究斑馬魚中uba6和uba7基因的功能提供了重要材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

野生型斑馬魚品系AB Tüebingen品系。

1.1.2 質粒

另外，教師在實踐中要引導學生自己摸索實驗條件，想辦法改進操作方法。例如，某小組探究“綠色蔬菜變黃過程中色素的變化”，預計提取、分離新鮮和放置變黃后的菠菜葉中的色素進行比較，但時值5月，菠菜放在冰箱，沒變太黃前就腐爛了，教師要引導學生分析原因，摸索儲存條件，或探尋其他的實驗方法。某小組探究“紅花檵木紫色葉片中的色素種類”設計了用清水紙層析分離色素的實驗組。實驗過程中發現，濾紙條吸水后變軟變重，會貼壁或倒入水中。因此，不能像平時實驗中那樣把濾紙條靠在試管或小燒杯壁上，學生自主進行了改進：使用試管架和夾子把濾紙條固定并吊在液面上方，保證下端沒入水中而不會整根濾紙條倒入水中。

TALEN載體為pCS2-FokⅠ，靶向uba6基因外顯子5和uba7基因外顯子2的TALEN質粒由北京唯尚立德生物科技有限公司合成。uba6靶位點：CTGGGCACCAACTTCT tcatcagagaggagg ATGTGAATA ATCAGA，其中左臂 TALE識別序列 CTGGGCA CCAACTTCT 16 bp，右臂TALE識別序列TCTGATT ATTCACAT 15 bp，間隔15 bp，突變體檢測酶BseRI識別序列 GAGGAG。uba7靶位點：TGCCAAAAA CGTGATcctggctggagttagaACAGTTACAATTCAGG，其中左臂TALE識別序列TGCCAAAAA CGTGAT 15 bp，右臂TALE識別序列CCTGAATTGTAACTGT 16 bp，間隔16 bp，突變體檢測酶Bpm I識別序列CTGGAG。

1.1.3 引物

uba6基因外顯子5擴增引物：TTGCTGATATAG GTGACTTGGAG（正向），CACATTAACCTTTCAC CGGAAG（反向）；uba7基因外顯子2擴增引物：GGTAATTATTTTGGCACCAACAGC（正向），GGAGT TACAAATGCCTATGTGCC（反向）。

1.1.4 主要試劑

本文實驗所用引物由上海生工生物技術公司以及上海Invitrogen公司合成。限制性內切酶購自NEB公司；AxyPrepTM plasimid Miniprep Kit和AxyPrepTM PCRCleanup Kit購自 Axygen公司；T4 DNA連接酶購自Roche公司；體外轉錄試劑購自Ambion公司。

1.2 方法

1.2.1 胚胎收集

在成年斑馬魚交配前一天將斑馬魚置于有適量養殖系統水的交配盒中，用擋板將雌雄斑馬魚分開。次日早晨，將擋板拔出，斑馬魚產卵，30 min后可收集，放置于28℃恒溫培養，在胚胎12 hpf（hour post-fertilization）時加入0.03％PTU抑制色素形成。

1.2.2 全胚胎原位雜交

探針合成與全胚胎原位雜交實驗依據已有報導進行［9]。本實驗中所用uba6和uba7RNA反義探針濃度為1 ug/mL。

1.2.3 斑馬魚uba6和uba7突變體的構建

將體外轉錄的編碼識別TALE左右臂序列蛋白和核酸酶融合蛋白的mRNA等量混合顯微注射入一細胞期斑馬魚胚胎，注射濃度為500 pg/nL。在1.5 dpf（day post-fertilization）收集胚胎至EP管中，每管8個胚胎，加入80 uL 50 mmol/L NaOH溶液，95℃加熱裂解10 min，冷卻后加入 8 uL 1mol/L Tris8.0混合均勻，即為提取的基因組DNA。以此基因組DNA為模板進行PCR反應，擴增產物用特定的酶進行酶切檢測。如果對照組胚胎的PCR產物能夠全部被切開，而注射過mRNA的實驗組胚胎的PCR產物中有未切開的PCR條帶，則說明靶點發生了突變，TALEN質粒有效。將注射后的斑馬魚胚胎飼養至成魚，為F0代。F0代與野生型交配產卵，收集胚胎，重復上述步驟提取基因組DNA、PCR擴增及酶切檢測，確定此F0是否在生殖細胞水平攜帶突變，如攜帶突變，將F0與野生型生產的胚胎飼養至成魚，為F1代。拔取F1成魚鱗片，將魚鱗片放入PCR管中，加入10 uL 50 mmol/L NaOH溶液，95℃加熱裂解 10 min，冷卻后加入 8 uL 1mol/L Tris8.0混合均勻，獲得基因組DNA。以此基因組DNA為模板進行PCR反應，擴增產物純化后送樣測序，通過讀取套峰獲得斑馬魚F1突變類型。

2 結果

2.1 斑馬魚uba6基因的時空表達模式

檢測基因時空表達模式有助于研究基因的功能。我們運用全胚胎原位雜交的方法檢測了斑馬魚中uba6基因早期的表達模式。結果顯示uba6呈現全身性表達，在1～3 dpf時于腸中有一定程度的富集，此富集隨發育的進行趨于明顯（彩插3圖1）。

2.2 斑馬魚uba7基因的時空表達模式

類似于uba6基因，我們也檢測了uba7基因的時空表達模式。結果顯示，uba7基因在1～3 dpf的斑馬魚胚胎中表達，表達模式為全身性，在腸中稍有富集（彩插3圖2）。

2.3 斑馬魚中uba6和uba7突變體建立

2.3.1 TALEN質?；钚詸z測

為檢測TALEN靶點設計是否工作，必須檢測質粒的活性。將以質粒為模板體外轉錄的mRNA注射至一細胞期的斑馬魚胚胎中，提取注射后胚胎的基因組DNA，PCR擴增包含靶點的DNA片段，酶切檢測此片段能否被切開。結果如圖3所示，對照組野生型胚胎的PCR產物能夠完全被切開；而實驗組即注射了mRNA的斑馬魚胚胎中部分PCR產物被切開，部分PCR產物未被切開，說明該靶點發生了突變，且效率較高。

2.3.2 F0突變體篩選

將上述實驗中注射mRNA的斑馬魚飼養至成魚，為F0代。F0是野生型和突變型細胞的嵌合體，為檢測突變是否產生在生殖細胞水平，將F0代與野生型交配產生F1子代，提取F1胚胎的基因組DNA，采取2.3.1中相同的策略，即PCR擴增含靶位點的基因組DNA并酶切檢測。結果如圖3所示，對照組野生型的PCR產物能夠完全被切開；而實驗組PCR產物未能被全部切開，這說明部分F1子代含有靶位點突變，F0代含有可遺傳的突變，將F1代斑馬魚胚胎飼養至成魚。

圖3 TALEN質?；钚詸z測及F0篩選Note：asterisk，PCR product；arrowhead，enzyme digest products.Fig.3 Activity tests of TALEN plasmids and F0 screen

2.3.3 F1突變體篩選

F1代斑馬魚中含有野生型和雜合突變體，為鑒定出雜合突變體，拔取少許F1成魚鱗片，提取基因組DNA，擴增含有靶位點的基因組DNA片段，測序檢測靶位點序列，測序結果顯示F1代含有多種突變類型，表1和表2分別列舉了F1代中篩選獲得的移碼突變類型，其中紅色標記部分是TALEN設計敲除的靶位點序列，這些移碼突變都可以產生早熟終止密碼子。

表1 TALEN uba6 F1突變類型Tab.1 TALEN uba6 F1 mutation type

表2 TALEN uba7 F1突變類型Tab.2 TALEN uba7 F1 mutation type

3 討論

小鼠中的研究表明，UBA6基因敲除會導致突變體胚胎在E10.5死亡［4]，而UBA7基因的敲除雖然不影響小鼠的存活與生殖，但是會導致ISG15蛋白修飾的缺失［6]。斑馬魚中這兩個基因的功能未有報道，我們構建的uba6和uba7突變體將是在斑馬魚中研究其功能的出發材料?；虻臅r空表達模式結果顯示，兩個基因在胚胎期都有表達，這提示著兩個基因有可能調控斑馬魚的胚胎發育。盡管我們獲得的突變體中基因突變會導致移碼，但是它們有可能不會導致胚胎出現發育缺陷表型，可能的原因有以下幾種（1）斑馬魚中有其他基因（例如可能存在的復制基因、功能相似的基因等）補償了突變基因的功能；（2）斑馬魚uba6和uba7基因有可能存在多種異構體，突變并沒有導致所以異構體移碼突變；（3）兩者不是斑馬魚胚胎發育必需的基因。

運用TALEN技術構建突變體，可以獲得多種突變類型，通常都是小片段DNA的插入或缺失。我們的實驗中也獲得了多種突變類型，只保留了引起移碼的突變，這些突變都導致了早熟終止密碼子的出現，從理論上分析這些突變可以導致基因功能喪失，但是還是需要其他分子生物學方法的驗證。

［1] Hershko A，Ciechanover A.The ubiquitin system［J].Annu Rev Biochem.1998，67：425-479.

［2] Pelzer C，Kassner I，Matentzoglu K，etal.UBE1L2，a novel E1 enzyme specific for ubiquitin［J].J Biol Chem.2007，282 （32）：23010-23014.

［3] Jin J，Li X，Gygi SP，et al.Dual E1 activation systems for ubiquitin differentially regulate E2 enzyme charging ［J].Nature.2007，447（7148）：1135-1138.

［4] Chiu YH，Sun Q，Chen ZJ.E1-L2 activates both ubiquitin and FAT10［J].Mol Cell.2007，27（6）：1014-1023.

［5] Yuan W，Krug RM.Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon（IFN）-induced ubiquitin-like ISG15 protein［J].EMBO J.2001，20（3）：362-371.

［6] Kim KI，Yan M，Malakhova O，et al.Ube1L and protein ISGylation are not essential for alpha/beta interferon signaling［J].Mol Cell Biol.2006，26（2）：472-479.

［7] Miller JC，Tan S，Qiao G，et al.A TALE nuclease architecture for efficientgenome editing［J].Nat Biotechnol.2011，29：143–148.

［8] ZhongweiQiu，Meizhen Liu， Zhaohua Chen， et al. Highefficiency and heritable gene targeting in mouse by transcription activator-like effector nucleases［J].Nucleic Acids Res.2013，41（11）：e120.

［9] Huang H，Ruan H，Aw M Y，et al.Mypt1-mediated spatial positioning of Bmp2-producing cells is essential for liver organogenesis［J].Development.2008，135（19）：3209 -3218.

Construction and identification of zebrafish uba6 and uba7 mutants by TALEN

DING Hui-mei，RUAN Hua，HUANG Hong-hui
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development，Ministry of Education，State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environments and Bio-Resources of the Three Gorges Reservoir Region，School of Life Sciences，Southwest University，Beibei，Chongqing 400715，China）

Objective To construct zebrafish uba6 and uba7mutants.Method In-delswere introduced into coding regions of zebrafish uba6 and uba7 gene by TALEN technology，andmutation typeswere identified by sequencing.Results We obtained two uba6 and three uba7mutantswith different small fragment deletions resulting in reading frame shifts.Conclusion These uba6 and uba7mutants provided startingmaterials for the study of zebrafish uba6 and uba7 gene functions.

Zebrafish；uba6；uba7；TALEN

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0007-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.002

國家自然科學基金面上項目（31071286）；西南大學中央高?；究蒲袠I務費（XDJK2014A013；2362014xk02）。

丁慧美（1990-），女，碩士，研究方向：發育生物學E-mail：15895840307@163.com。

黃紅輝（1974-），男，博士，教授，研究方向：發育生物學E-mail：honghuih@126.com；阮華（1974-），女，博士，教授，研究方向：發育生物學，E-mail：ruanhua23@126.com。

﹞2015-08-18

研究報告