救腦益智方劑水提液對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的保護作用

張景燕，張靜爽，曹子青，趙志煒，張 旭，吳燕川，王玉蘭，王 蓉

（1.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053；2.北京京師中醫醫院，北京 100026）

救腦益智方劑水提液對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的保護作用

張景燕1，張靜爽1，曹子青2，趙志煒1，張 旭1，吳燕川1，王玉蘭1，王 蓉1

（1.首都醫科大學宣武醫院中心實驗室，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經變性病教育部重點實驗室，北京 100053；2.北京京師中醫醫院，北京 100026）

目的通過觀察復方中藥救腦益智方劑水提液對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞生長以及胰島素信號通路的影響，探討其對神經細胞保護作用的機制。方法 體外培養SH-SY5Y細胞，分為對照組（C組）、救腦益智1號方組和3號方組，每組藥物劑量分別為0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，測定各組細胞的噻唑藍（MTT）代謝率，選定0.125 mg/mL進行細胞免疫熒光染色，觀察細胞形態和胰島素受體底物-1（IRS-1）、cAMP反應元件結合蛋白（CREB）表達的變化。結果 與對照組相比，救腦益智組MTT代謝率升高（P＜0.05），細胞形態好，表現為細胞胞體飽滿、貼壁良好、突起延長，IRS-1和CREB表達增加。結論 復方中藥救腦益智水提液能促進神經細胞生長，提高神經元胰島素信號通路相關因子IRS-1和CREB表達，推測其神經保護作用機制與胰島素信號通路有關。

阿爾茨海默病；復方中藥，救腦益智方劑；人神經母細胞瘤株SH-SY5Y

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD，又稱老年性癡呆）是以認知功能障礙為主要表現的、漸進性加重的神經系統變性病，臨床上80％以上的患者屬于病因不清、發病機制不明的散發性AD，由于缺乏有效的早期診斷和治療措施，AD已經成為繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后威脅人類健康的第四大殺手［1-3］。AD的發病機制十分復雜，近年來，腦內神經元胰島素信號通路障礙在AD發生發展中的作用越來越引起學者們的關注［4-6］。

救腦益智膠囊的主要成分有生黃芪、黨參、白術、龜甲、穿山甲、肉蓯蓉等，具有益氣養血、滋補肝腎、化痰祛痕、健腦益智功效，在臨床上對一些腦萎縮病人有較好的治療作用［7］。以往研究發現救腦益智膠囊能促進神經元胞體增大和突起延長［8］，并能促進SY5Y神經母細胞存活信號通路中Akt/PKB，P-CREB的表達［9］。本研究擬通過觀察救腦益智膠囊的改良配方（1號方和3號方）方劑水提液對人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞生長以及胰島素信號通路的影響，探討其對神經細胞保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株：人神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞來自瑞典卡羅琳斯卡醫學院。

1.1.2 藥品與試劑：救腦益智水提液由救腦益智膠囊制成（膠囊主要成分包括黃芪、黨參、肉蓯蓉、龜板、當歸、白芍等20余味中草藥，形態為粉劑，使用前用電子天平稱重，然后加蒸餾水煮沸15 min，離心取出上清液，再向沉淀物中加入蒸餾水煮沸15 min，離心取上清液，將兩次取出的上清液混合，濃度調整為1 g生藥/3 mL，即若蒸餾100 g生藥將得到300 mL水提 液）。MTT（噻 唑 藍，3-［4，5-dimethylthylthiazol-2-yl］-2，5diphenyltetrazolium broide）系Sigma產品。二甲基亞砜（DMSO）系北京亞太精細化工公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：使用含10％胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5％CO2培養箱中培養，3 d換液1次，6 d傳代1次。

1.2.2 測定MTT代謝率：將生長狀態良好、傳代穩定的SH-SY5Y細胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（Nunc產品）中，每孔各加200 μL，培養48 h后分為3組：對照組、救腦益智1號方組（主要成分包括黃芪、黨參、補骨脂等）和3號方組（主要成分包括人參、益智仁、鹿角等），進行后續實驗。各藥物組所加相應藥物的濃度分別為 0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，各組培養液體積和接種細胞數相等。繼續培養24 h后加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL/孔，于37℃孵育4 h后吸出培養液，再加DMSO溶液200 μL/孔，振搖 10min后用全波長酶標儀（Multiskan Spectrum）測定550 nm處吸光度值（A）。

1.2.3 細胞免疫熒光染色：將SH-SY5Y細胞以1× 104/mL的密度接種于24孔板中，每孔各加1 mL，于培養箱中培養48 h后分為以上3組進行后續實驗，根據MTT結果選用0.125 mg/mL藥物劑量作用細胞24 h，然后吸棄培養液，用PBS漂洗1次，加入4％多聚甲醛固定30 min，10％山羊血清封閉1 h，加入一抗（IRS-1抗體、CREB抗體，1：100）于4℃孵育過夜，用PBS漂洗后加相應二抗（1：200）孵育1 h，PBS漂洗后于熒光倒置顯微鏡下觀察并采集影像。

1.3 統計學方法

使用SPSS 17.0軟件進行統計，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT代謝率測定

MTT檢測結果顯示，救腦益智1號方組和3號方組的SH-SY5Y細胞MTT代謝率升高，線粒體活性增強，與對照組相比，P＜0.05，差異有統計學意義（表1）。

表1 救腦益智1號方組和3號方組對SH-SY5Y細胞MTT代謝率的影響Tab.1 Effect of Jiu Nao Yi Zhi No.1 or No.3 prescription on the metabolic rate in SH-SY5Y cells

2.2 細胞免疫熒光染色

從細胞形態上看，救腦益智1號方和3號方的細胞形態相對好，細胞胞體飽滿、貼壁良好、突起延長；另外，與對照組相比，1號方和3號方的細胞中IRS-1和CREB表達增加。各組SH-SY5Y細胞的形態及CREB、IRS-1的表達情況分別見圖1、圖2（圖1，2見文后彩插5）。

3 討論

救腦益智膠囊的主要成分有生黃芪、黨參、白術、肉蓯蓉等，具有益氣養血、滋補肝腎、化痰祛痕、健腦益智功效，可用于氣血肝腎虧虛、痰疲阻滯引起的健忘不寐，神情呆滯，眩暈耳鳴，言語蹇澀，肢體瘓軟，步履艱難等癥候者［7］。我們曾經研究發現，救腦益智提取液能促進體外培養的人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）生長，推測其機理可能與其促進神經元信號通路中有關蛋白質的表達有關［9］，此后我們一直在研究與之相關的蛋白質及其作用途徑。

本研究結果表明，救腦益智水提液能促進SHSY5Y細胞胞體體積的增大和突起的延長，并能提高MTT代謝率。MTT是琥珀酸脫氫酶的作用底物，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使其還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO溶解細胞中的甲瓚，用全波長酶標儀在550 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。MTT值越大，代表活細胞數目越多。

眾所周知，神經元可通過多條途徑使自身存活，而IRS-PI3K/Akt-BAD-CREB途徑即是其主要途徑之一，IRS磷酸化后激活PI3K/Akt，最終使CREB磷酸化，從而使神經元存活。本室以往的研究結果表明救腦益智膠囊水提液能提高使SH-SY5Y細胞存活的PI3K信號通路中Akt和p-CREB的表達水平，而Akt表達增加可促進CREB磷酸化增加，即與本室得出的研究結果p-CREB表達增加一致，而SY5Y細胞的存活一方面依賴于p-CREB表達水平的提高［9］。本研究結果表明，救腦益智方劑水提液也可使IRS-1、CREB表達增加，由此可以推斷救腦益智方劑水提液中含有某些神經營養成分，而且可以通過影響胰島素信號通路中蛋白的表達水平，而發揮保護神經細胞并促進其生長的作用。但是體外實驗有效不等同于藥物在體內也有效，因此仍需進行充分的體內試驗。

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［8］張景燕，孟艷，趙志煒，等.救腦益智膠囊對人神經母細胞瘤株SYSY生長的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2002，22：82-83.

［9］孟艷，張景燕，王蓉，等.救腦益智膠囊水提物對人神經母細胞瘤株SY5Y信號轉導的影響［J］.中國中藥雜志，2003，28（11）：1076-1077.

Protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line

ZHANG Jing-yan1，ZHANG Jing-shuang1，CAO Zi-qing2，ZHAO Zhi-wei1，ZHANG Xu1，WU Yan-chuan，1WANG Yu-lan1，WANG Rong1
（1.Central Laboratory，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Center of Alzheimer’s Disease，Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing 100053，China；2.Beijing Municipal Chinese Medicine Hospital，Beijing 100026，China）

Objective To observe the protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line，its effect on expression of insulin signal transduction pathway，and to explore the related mechanisms.Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro，were divided into control group，Jiu Nao Yi Zhi No.1 prescription group and No.3 prescription group.The doses were 0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL and 1 mg/mL.The thiazolyl blue（MTT）metabolic rate of each group was determined.The dose of 0.125 mg/mL was chosen for cell immunofluorescence analysis，and to observe the expression of insulin receptor substrates-1（IRS-1），cAMP response element binding protein（CREB），and the factors of insulin signal transduction pathway.Results Compared with the control group，MTT metabolic rates of the Jiu Nao Yi Zhi groups were significantly increased（P＜0.05），and the cell morphology was much better in those groups，cell body more plump，welladherent and neurite extensions were observed.The expressions of IRS-1 and CREB were higher than that in the control group.Conclusions The traditional Chinese medicine prescription Jiu Nao Yi Zhi water extract can protect neurons by promoting nerve cell growth，and improving the expression of IRS-1 and CREB，the factors of insulin signal transduction pathway.

Alzheimer’s disease；Traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi；Human neuroblastoma，cell line SH-SY5Y；Neuroprotection

R33

A

1671-7856（2015）04-0058-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.011

北京市自然科學基金（7132044）；首都衛生發展科研專項項目（2011-1001-02）；北京市衛生系統高層次衛生技術人才計劃資助項目（2009-3-64）。

張景燕，女，主管技師，研究方向：細胞生物學，E-mail：908436005@qq.com。

王蓉，女，研究員，博士研究生導師，研究方向：神經元退行性變的發生機制和防治策略。E-mail：rong_wang72@aliyun.com。

2015-02-10