大鼠羊膜細胞體外培養及其干細胞標記物的表達

曲春輝，張 玲，武 杰，巨榮凱，朱 華，黃 瀾，徐艷峰，白 琳，秦 川

（北京協和醫學院中國醫學科學院醫學實驗動物研究所病理室，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

大鼠羊膜細胞體外培養及其干細胞標記物的表達

曲春輝，張 玲，武 杰，巨榮凱，朱 華，黃 瀾，徐艷峰，白 琳，秦 川

（北京協和醫學院中國醫學科學院醫學實驗動物研究所病理室，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

目的分離并鑒定大鼠羊膜細胞，探索羊膜細胞分化潛能，為干細胞移植治療探尋新的細胞來源。方法 機械分離羊膜組織并采用0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化，應用高糖-DMEM培養基（添加10 μg/L人表皮生長因子）培養，采用流式細胞術檢測間充質干細胞表面標志物，通過細胞免疫熒光染色檢測神經干細胞表面標記物。結果 大鼠羊膜組織可分離并培養，細胞呈梭型，貼壁生長，短期內可以穩定增殖。細胞表達干細胞表面標記物八聚體結合轉錄因子4（octamer-binding transcription factor，Oct-4）和性別決定區Y框蛋白（sex determining region Y box 2，Sox-2），間充質干細胞表面標志物vimentin，胚胎干細胞標記物階段特異性胚胎表面標記物（stage specific embryonic antigen-4，SSEA-4），并表達神經干細胞表面標志物nestin，可表達腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和神經生長因子（nerve growth factor，NGF）。結論 大鼠羊膜細胞可表達間充質干細胞和神經干細胞標記物，并有神經營養因子表達，為大鼠羊膜細胞的研究和應用提供實驗依據。

羊膜細胞；體外培養；間充質干細胞標志物；神經干細胞標志物；神經生長因子；大鼠

羊膜位于胎盤絨毛膜內側，是一層無血管、神經、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到對胎兒的保護作用，與發育中的胎兒聯系緊密。人源羊膜細胞在受精后第8天開始形成，具有多項分化的潛能，可向三個胚層細胞進行分化，近年來研究表明，羊膜上皮細胞能夠分化為成熟的神經細胞，并合成釋放多巴胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素等神經遞質［1］。人羊膜細胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，細胞移植后不會發生急性排斥反應［2］。本實驗從大鼠羊膜分離獲取羊膜細胞，建立穩定培養的條件，并對其生物學特性進行了探討，為其將來在細胞移植治療方面的應用提供實驗依據。

1 材料和方法：

1.1 材料

1.1.1 主要儀器：CO2培養箱、凈化工作臺、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細胞儀。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養基（Dulbecco‘s modified Eagle’s medium，DMEM）、人表皮生長因子（EGF）、0.25％含EDTA的胰蛋白酶（0.25％trysin-EDTA）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、抗生素（penicillin，streptomycin）、PBS緩沖液購自于Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90購自與Abcam公司。CD29、CD44購自于eBioscience公司、CD45、CD11b購自于BD公司。

1.1.3 實驗動物：SPF級孕18～18.5 d的SD大鼠，購自中國軍科院實驗動物中心，許可證號：［SCXK-（軍）2014-0004］，實驗動物使用批準號：ILAS-PL-2014-001。在無菌條件下進行實驗操作分離羊膜組織。

1.2 方法

1.2.1 羊膜細胞分離及培養：SD孕鼠腹腔注射1 ％戊巴比妥鈉（0.01 mL/g），麻醉后，無菌條件下開腹，機械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL雙抗的PBS溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL雙抗的DMEM基礎培養基中，無菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入0.25％含EDTA的胰蛋白酶10 mL，37℃，5％CO2條件下消化20～30 min。用含有10％胎牛血清的完全培養基終止消化。200目不銹鋼濾網過濾單細胞懸液，接種至25 cm2培養瓶，含10％FBS、10 μg/LEGF和500 U/mL雙抗的DMEM完全培養基培養，隔天細胞換液，2～3 d后細胞長滿培養瓶85％～90％時，進行細胞傳代。

1.2.2 流式細胞術檢測：取培養2～4代細胞，用0.25％含EDTA的胰蛋白酶消化，含10％FBS的DMEM完全培養基終止消化。細胞計數將其稀釋成1×106個，每個流式管1 mL細胞懸液。每流式管加2 mL PBS使細胞混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。重復加2 mL PBS重懸細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加50 μL PBS重懸細胞，加抗體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育30 min。每管加2 mL PBS重懸細胞2000 r/min離心5 min，棄上清液。各管加300 μL PBS重懸細胞上機檢測。

1.2.3 免疫熒光細胞染色：取2～4代細胞，0.25％含EDTA胰蛋白酶消化，含10％FBS的DMEM完全培養基終止消化。加入完全培養基重懸，至24孔板中培養。待細胞增殖至70％作用時，PBS沖洗，4％多聚甲醛（預冷）固定10 min。PBS沖洗2次，每次5 mim。1％Tuiton-100×孵育10 min。PBS沖洗2次，每次5 mim。山羊血清工作液每孔100 μL室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體Oct-4（1∶200）、Sox-2（1∶200）、SSEA-4（1∶200）、nestin（1∶100）、vimentin（1∶100），每孔100 μL，4℃過夜孵育。PBS沖洗3次，每次5 min。避光條件下，PBS稀釋 FITC標記的羊抗鼠二抗（1∶200），37℃避光孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。DAPI封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 分離細胞培養

分離培養大鼠羊膜細胞，鏡下，細胞呈變形蟲樣生長（圖1a），生長速度快（圖1b），需隔天換液傳代。本實驗中大鼠羊膜細胞可傳至6～7代。

2.2 流式細胞術鑒定細胞表面抗原結果

經流式細胞術鑒定大鼠羊膜細胞間充質細胞表面標記物CD29、CD44分別為97.6％和95.8％。細胞表面抗原CD90、CD45幾乎不表達，CD11b有少量表達（圖2見文后彩插6）。

2.3 細胞免疫熒光鑒定細胞表面標記物結果

本實驗通過細胞免疫熒光方法檢測大鼠羊膜細胞表達干細胞標記物Oct-4和Sox-2（如圖3），神經干細胞標記物 nestin和間充質干細胞標記物vimentin（如圖4），（圖3～4見文后彩插7）并表達胚胎干細胞標記物SSEA-4（如圖5）。可表達神經營養因子BDNF和NGF（如圖6）（圖5～6見文后彩插8）。

3 討論

通過細胞免疫熒光實驗發現大鼠羊膜細胞表達干細胞表面標記物Oct-4和Sox-2，間充質細胞標記物vimentin和神經細胞標記物nestin，表達SSEA-4。可表達神經營養因子標記物BDNF和NGF，這些神經營養因子是神經元生長與存活所必需的蛋白質分子［3］。羊膜細胞表達間充質干細胞標記物CD29和CD44，其表達量均在95％以上，CD45、CD90幾乎不表達，CD11-b有少量表達。

Oct-4可參與胚胎干細胞的自我更新［4，5］，調節胚胎干細胞的多分化潛能［6］。有研究指出Oct-4在羊膜細胞核內及細胞質均可表達［7］。Miki等人研究結果表明人羊膜上皮細胞和間充質細胞都可表達Sox-2、Oct-4等干細胞標志物［1］。本實驗結果顯示在大鼠羊膜細胞中Oct-4在胞核和胞質中均有表達。

Nestin被認為是在胚胎和成體組織中的多能性神經干細胞的標記物［8-10］。在有絲分裂活躍的中樞神經系統和周圍神經系統細胞中表達，現作為神經干細胞的標記物被廣泛應用［11］。人羊膜來源的間充質干細胞經體外誘導分化，可分化為神經樣細胞并表達nestin、Oct-4和Sox-2［12］。Vimentin起到維持細胞形態，胞質完整性和穩定細胞骨架的作用。有研究發現在妊娠15 d的大鼠胚胎中檢測有nestin和vimentin的表達，人羊膜細胞未分化的前體細胞中也存在 nestin、vimentin表達［13，14］。有研究發現大鼠羊膜細胞和人羊膜細胞中都表達nestin和vimentin因子［15-19］。SSEA-4被認為是特異性人胚胎干細胞和卵泡期胚胎早期卵裂的標記物，也被視為成體間充質干細胞的標記物［20］。Ilancheran等與他的同事MIKI等分別通過實驗證明了人羊膜上皮細胞表達胚胎干細胞表面標記物SSEA-4［1，21］。本實驗通過細胞免疫熒光方法檢測出大鼠羊膜細胞表達nestin、vimentin和SSEA-4。

圖1 分離并培養大鼠羊膜細胞，細胞呈變形蟲樣生長（標尺=100 μm）。Note.（a）Rat amniotic cells cultured for 2 days，（b）Rat amniotic cells cultured for 3 days.Fig.1 Ameboid-shaped rat amniotic cells can be seen at 2 days（a）and 3 days（b）after isolation and culture.（Scale bar=100 μm）

NGF和BDNF都是神經營養因子家族中成員。NGF同時也是一種信號分子［22］，缺乏NGF對神經元的營養作用，神經元會出現凋亡［23］。BDNF可促進神經元的存活并能支持神經元和突觸的生長和分化［3］。BDNF可減少突觸喪失、矯正部分異常基因表達、阻止神經元萎縮且改善與年齡相關的認知障礙，提高學習記憶能力［24，25］。研究人員發現人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質細胞可合成釋放神經營養因子BDNF、NGF和NT-3，其他的神經營養因子通過細胞培養后檢測沒有表達［2，12，26，27］。多個實驗證實通過移植人羊膜細胞到損傷部位能修復受損傷的神經元，BDNF的表達水平同時增加［28-30］，說明人羊膜細胞很可能通過釋放BDNF來修復損傷神經元的功能。本實驗中通過細胞免疫熒光方法也發現大鼠羊膜細胞表達神經營養因子BDNF和NGF。

人羊膜間充質細胞可表達間充質細胞標記物CD29、CD44、CD73、CD90、CD166和CD105，不表達骨髓造血標記物CD34和CD45、單核細胞標記物CD114和巨噬細胞標記物 CD11b［1，31，32］。Murphy等在研究人羊膜上皮細胞特點時發現，人羊膜上皮細胞表達上皮粘附分子EpCAM，幾乎不表達CD90和CD105［33］。而人羊膜間充質細胞表達 CD90、CD73和CD105，其表達量都在95％以上，CD45、CD34表達量少于2％［34］。Bailo等發現人羊膜細胞表達CD105、CD73、CD90和CD29，不表達CD34、CD45、CD14和CD3［18］。本實驗中通過流式細胞術方法檢測到大鼠羊膜細胞表達CD29和CD44，不表達CD90、CD45，少量表達CD11b。

羊膜細胞易于分離培養，細胞生長速度快，免疫原性低，并有向三個胚層分化的潛能，在相關疾病的治療中具有很好的前景。本實驗較為系統地檢測了大鼠羊膜細胞的四類干細胞標記物，發現大鼠羊膜細胞可表達干細胞表面標記物Oct-4和Sox-2、胚胎干細胞標記物SSEA-4、間充質干細胞標記物vimentin和神經干細胞標記物nestin，并同時還表達神經生長因子BDNF和NGF。由此，我們推測大鼠羊膜細胞很可能具有某些間充質干細胞和神經干細胞的特性，為相關基礎研究和神經系統疾病的治療提供了一些線索。

［1］Miki T，Lehmann T，Cai H，et al.Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells［J］.Stem Cells，2005，23（10）：1549 -1559.

［2］Fairbairn NG，Randolph MA，Redmond RW.The clinical applications of human amnion in plastic surgery［J］.J Plast Reconstr Aesthet Surg，2014，67（5）：662-675.

［3］Huang EJ，Reichardt LF.Neurotrophins：roles in neuronal development and function［J］.Annu Rev Neurosci，2001，24：677-736.

［4］Takeda J，S Seino S，Bell GI.Human Oct3 gene family：cDNA sequences，alternative splicing，gene organization，chromosomal location，and expression at low levels in adult tissues［J］.Nucleic Acids Res，1992，20（17）：4613-4620.

［5］Boyer LA，Lee TI，Cole MF，et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells［J］.Cell，2005，122（6）：947-956.

［6］Pesce M，Scholer HR.Oct-4：gatekeeper in the beginnings of mammalian development［J］.Stem Cells，2001，19（4）：271-278.

［7］Miki T.Amnion-derived stem cells：in questofclinical applications［J］.Stem Cell Res Ther，2011，2（3）：25.

［8］Kim JS，Kim J，Kim Y，et al.Differential patterns of nestin and glial fibrillary acidic protein expression in mouse hippocampus during postnatal development［J］.J Vet Sci，2011，12（1）：1 -6.

［9］Messam CA，Hou J，Berman JW，et al.Analysis of the temporal expression of nestin in human fetal brain derived neuronal and glial progenitor cells［J］.Brain Res Dev Brain Res，2002，134（1-2）：87-92.

［10］Wong A，Ghassemi E，Yellowley CE.Nestin expression in mesenchymal stromal cells：regulation by hypoxia and osteogenesis［J］.BMC Vet Res，2014，10（1）：173.

［11］Michalczyk K，Ziman M.Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organisation［J］.Histol Histopathol，2005，20（2）：665-671.

［12］Yan ZJ，Zhang P，Hu YQ，et al.Neural stem-like cells derived from human amnion tissue are effective in treating traumatic brain injury in rat［J］.Neurochem Res，2013，38（5）：1022-1033.

［13］Shinya M，Komuro H，Saihara R，et al.Neural differentiation potential of rat amniotic epithelial cells［J］.Fetal Pediatr Pathol，2010，29（3）：133-143.

［14］Sakuragawa N，Thangavel R，Mizuguchi M，et al.Expression of markers for both neuronal and glial cells in human amniotic epithelial cells［J］.Neurosci Lett，1996，209（1）：9-12.

［15］MarcusAJ，Coyne TM，Rauch J，et al.Isolation，characterization，and differentiation of stem cells derived from the rat amniotic membrane［J］.Differentiation，2008，76（2）：130 -144.

［16］Marcus AJ，Coyne TM，Black IB，et al.Fate of amnion-derived stem cells transplanted to the fetal rat brain：migration，survival and differentiation［J］.J Cell Mol Med，2008，12（4）：1256-1264.

［17］Mamede AC，Carvalho MJ，Abrantes AM，et al.Amniotic membrane：from structure and functions to clinical applications［J］.Cell Tissue Res，2012，349（2）：447-458.

［18］Bailo M，Soncini M，Vertua E，et al.Engraftment potential of human amnion and chorion cells derived from term placenta［J］.Transplantation，2004，78（10）：1439-1448.

［19］陳宥藝，陸琰，王科，等.羊膜上皮細胞體外培養條件的優化及其干細胞標志的表達［J］.中國實驗血液學雜志，2011，19（2）：464-468.

［20］Gang EJ，Bosnakovski D，Figueiredo CA，et al.SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow［J］.Blood，2007，109（4）：1743-1751.

［21］Ilancheran S，Michalska A，Peh G，et al.Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential［J］.Biol Reprod，2007，77（3）：577-588.

［22］Fiore M，Chaldakov GN，Aloe L.Nerve growth factor as a signaling molecule for nerve cells and also for the neuroendocrineimmune systems［J］.Rev Neurosci，2009，20（2）：133-145.

［23］Freeman RS，Burch RL，Crowder RJ，et al.NGF deprivationinduced gene expression：after ten years，where do we stand？［J］Prog Brain Res，2004，146：111-126.

［24］Yamada K，Nabeshima T.Brain-derived neurotrophic factor/TrkB signaling in memory processes［J］.J Pharmacol Sci，2003，91（4）：267-270.

［25］Nagahara AH，Merrill DA，Coppola G，et al.Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimer’s disease［J］.Nat Med，2009，15（3）：331-337.

［26］Uchida S，Inanaga Y，Kobayashi M，et al.Neurotrophic function of conditioned medium from human amniotic epithelial cells［J］.J Neurosci Res，2000，62（4）：585-590.

［27］Castillo-Melendez M，Yawno T，Jenkin G，et al.Stem cell therapy to protect and repair the developing brain：a review of mechanisms of action of cord blood and amnion epithelial derived cells［J］.Front Neurosci，2013，7：194.

［28］Wu ZY，Hui GZ，Lu Y，et al.Transplantation of human amniotic epithelial cells improves hindlimb function in rats with spinal cord injury［J］.Chin Med J（Engl），2006，119（24）：2101-2107.

［29］Uchida S，Suzuki Y，Araie M，et al.Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells［J］.Neurosci Lett，2003，341（1）：1-4.

［30］Xue SR，Chen CF，Dong WL，et al.Intracerebroventricular transplantation of human amniotic epithelial cells ameliorates spatial memory deficit in the doubly transgenic mice coexpressing APPswe and PS1DeltaE9-deleted genes［J］.Chin Med J（Engl），2011，124（17）：2642-2648.

［31］Diaz-Prado S，Muinos-Lopez E，Hermida-Gomez T，et al.Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells for regenerative medicine［J］.Differentiation，2011，81（3）：162-171.

［32］方寧，宋秀軍，張路，等.人羊膜上皮細胞的分離培養及鑒定［J］.遵義醫學院學報，2009，32（2）：121-124.

［33］Murphy S，Rosli S，Acharya R，et al.Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use［J］.Curr Protoc Stem Cell Biol，2010，Chapter 1：Unit 1E 6.

［34］Parolini O，Alviano F，Bagnara GP，et al.Concise review：isolation and characterization of cells from human term placenta：outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells［J］.Stem Cells，2008，26（2）：300-311.

Isolation，culture and identification of rat amniotic cells in vitro and their expression of stem cell markers

QU Chun-hui，ZHANG Ling，WU Jie，JU Rong-kai，ZHU Hua，HUANG Lan，XU Yang-feng，BAI Lin，QIN Chuan
（Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College（PUMC）；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）；Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Disease Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

Objective To isolate and identify the rat amniotic cells and to explore their stem cell characteristics，so as to find a new cell source for stem cell transplantation.Methods Rat amnion tissue was mechanically separated from 18-18.5-day old SPF pregnant rats and 0.25％trysin-EDTA digestion was used to obtain amniotic cells.The isolated cells were cultured with DMEM D-glucose added with 10 μg/L EGF.Flow cytometry was used to detect the mesenchyme stem cellsurface markers.Neural stem cell surface markers of the rat amniotic cells were detected using immunofluorescence staining.Results The rat amniotic membrane tissue was separated and mesenchymal stem cells were cultured successfully.The cells were ameboid-shaped and showed adherent growth，and can stably proliferate in short term.Afterculture，the cells expressed stem cell markers e.g.Oct-4 and Sox-2，mesenchymal stem cell markers e.g.vimentin，embryonic stem cell markers e.g.SSEA-4，neural stem cell marker e.g.nestin，and could also express neurotrophic factors，such as BDNF and NGF.Conclusions Rat amniotic cells express mesenchymal stem cells markers，neural stem cell markers and neurotrophic factors，therefore，provide an experiment basis for further research and application of rat amniotic cells in stem cell transplantation.

Amniotic cells；Culture in vitro；Mesenchymal stem cells，marker；Neural stem cell，marker；Neutrophic factor；Rat

R33

A

1671-7856（2015）04-0061-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.012

國家高技術研究發展計劃（863計劃）課題實施方案SS2012AA022613。

曲春輝，女，碩士研究生，E-mail：quchunhui626@163.com。

秦川，教授，博士生導師，E-mail：qinchuan@pumc.edu.cn。

2015-02-02

技術方法