食蟹猴臍帶間充質干細胞的分離與鑒定

龐榮清，何 潔，李瑞生，趙 晶，朱 慧，3，朱向情，阮光萍，潘興華

（1.成都軍區昆明總醫院云南省干細胞工程實驗室，昆明 650032；2.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039；3.昆明醫科大學昆明總醫院臨床學院，昆明 650031）

食蟹猴臍帶間充質干細胞的分離與鑒定

龐榮清1，何 潔1，李瑞生2，趙 晶1，朱 慧1，3，朱向情1，阮光萍1，潘興華1

（1.成都軍區昆明總醫院云南省干細胞工程實驗室，昆明 650032；2.解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039；3.昆明醫科大學昆明總醫院臨床學院，昆明 650031）

目的建立食蟹猴臍帶間充質干細胞的分離培養方法。方法 新鮮食蟹猴臍帶剪碎為糊狀，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養液培養，觀察細胞形態特征，流式細胞技術分析細胞抗原標志的表達，并檢測其體外多向分化潛能。結果 運用組織貼塊法可以從新鮮臍帶中分離到貼壁生長、陽性表達CD29、CD44、CD90的成纖維細胞樣細胞。這些細胞在體外誘導培養后可分別檢測到脂滴、骨和軟骨細胞。結論 運用組織貼塊培養法可用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養液從食蟹猴臍帶中分離到間充質干細胞。

臍帶間充質干細胞；食蟹猴；培養方法

臍帶間充質干細胞是目前研究最多的種子細胞之一，在再生醫學和組織工程研究方面具有廣闊的應用前景［1］。食蟹猴是醫學研究常用的非人靈長類實驗動物［2］，雖然國內已建立了食蟹猴骨髓間充質干細胞（cynomolgus monkeybonemarrow mesenchymal stem cells，cBMMSC）的分離培養方法［3］，推動了食蟹猴在再生醫學研究中的廣泛應用［4］，但骨髓采集數量較少，短期內很難大量擴增cBMMSC，且cBMMSC活性容易受到供體年齡的限制［3，5］。目前尚未見食蟹猴臍帶間充質干細胞（cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells，cUCMSC）分離培養的報道，因此本實驗室在前期工作［6］的基礎上，試圖建立cUCMSC的分離培養方法，以滿足以食蟹猴為實驗動物大規模開展再生醫學和組織工程研究的需要。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設備

DMEM/F12培養液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和trypsin-EDTA均購自Invitrogen公司；FITC標記的抗猴流式單抗 CD29、CD34、CD44、CD90購自NeoMarkers公司；成脂、成骨、成軟骨誘導分化試劑盒購自Invitrogen公司；顯微鏡為Nikon公司產品，流式細胞儀為BD公司產品。

1.2 細胞培養

手術環境條件下，剖宮產取足月食蟹猴胎猴臍帶，送至無菌實驗條件下參照我們建立的方法［6］分離培養cUCMSC。即用雙抗液沖洗臍帶，然后將其在離心管內剪碎為糊狀，加入少許含有10％FBS的DMEM/F12并轉移至培養瓶中，于5％CO2、37℃的條件下靜置培養，適時換液。觀察細胞生長特性及形態特征。待細胞生長至融合狀態時，用 trypsin-EDTA消化傳代細胞。

1.3 流式細胞分析

參照我們建立的方法［6］收集生長良好的第三代細胞，加入流式抗體CD29、CD34、CD44、CD90室溫條件下避光孵育30 min，漂洗棄除未結合抗體后，用流式細胞儀檢測抗原標志的表達。

1.4 細胞分化潛能的鑒定

參照本實驗室的實驗數據，依據試劑盒說明書推薦的方法和實驗濃度進行，即收集生長良好的第三代細胞完成體外誘導實驗［6］。成脂分化：接種細胞（4×104/孔）于12孔板中培養6 h后，更換培養液為成脂誘導分化培養液，3至4天換液1次，連續培養14 d后，4％多聚甲醛固定后加入油紅O染色；成骨分化：按照上述成脂分化培養細胞，成骨誘導分化培養21天后，固定并加入茜素紅染色；成軟骨分化：收集細胞并調整細胞密度為1.6×107/mL，每孔加5 μL到12孔板的中心，形成一個細胞滴，2 h后再緩慢加入成軟骨誘導分化培養液，2至3天換液一次，隨著培養細胞會形成一個細胞團漂浮起來，連續培養14 d后，4％多聚甲醛固定后石蠟包埋作病理切片，脫蠟后加入阿新藍染色。

2 結果

2.1UCMSC的形態特征

從健康足月的剖宮產胎猴，可以一次獲得約5 cm長的臍帶，將其剪碎后采用貼壁培養的方法，在少許含10％FBS的DMEM/F12培養液中靜置培養5 d，即可在倒置相差顯微鏡下觀察到少數梭形貼壁生長的細胞，或見到組織塊周圍長出的貼壁生長細胞。這些細胞傳代后可快速密集排列呈漩渦狀生長，顯示與cBMMSC類似的生長特征（圖1，見彩插），初步判斷這些貼壁生長的成纖維細胞樣細胞就是cUCMSC。

2.2 細胞免疫表型分析

生長良好的第三代細胞經流式細胞儀檢測，結果顯示cUCMSC表達間充質細胞特異性抗原標志而不表達造血干細胞特異性標志。造血干細胞陽性標記CD34為陰性（圖2A），而CD29，CD90，CD44均陽性表達，陽性率均在95％以上（圖2B、2C、2D）。

2.3 分化潛能鑒定

體外誘導分化實驗顯示：第三代細胞經成軟骨分化誘導培養14 d后，固定并行病理切片檢測，可觀察到大量氨基葡聚糖被阿新蘭染成藍色（圖3A，A1），即成軟骨分化陽性。同樣，成脂分化誘導培養14 d后，可觀察到大量脂滴的出現，油紅O染色后，可見脂滴被染成紅色（圖3B，B1），即成脂分化陽性；成骨分化誘導培養21 d后，可觀察到白色結節，茜素紅染色后，可見鈣質結節被染成紅色（圖3C，C1），即成骨分化陽性（圖3見封三）。

3 討論

猴與人類基因組相似程度高達95％，是開展人類臨床前研究的珍貴實驗動物。食蟹猴具有體型小，飼養成本低，性情溫順，便于實驗操作等優點，近年來被越來越多地用于藥物安全性評價等生物醫學實驗研究［2］。隨著干細胞應用基礎研究不斷取得進展，迫切需要使用非人靈長類實驗動物廣泛開展干細胞臨床應用安全性評價實驗研究。臍帶是連接胎兒與胎盤的索狀結構組織，是胎兒與母體物質交換的主要通道。利用臍帶來分離擴增間充質干細胞，取材十分方便，可一次性獲得較多組織而在短時間內擴增出足夠數量的細胞；其次，臍帶屬于胎兒組織的一部分，含有胚胎發育過程中遺留的大量原始細胞，從臍帶組織中可以分離獲得增殖分化能力強的原始干細胞，不像BMMSC那樣容易受到供體年齡的限制［5，7］；此外，由于胎盤屏障的存在，使得臍帶受到各種病原微生物感染的機會較低。因此，臍帶是獲取間充質干細胞的重要組織來源。

圖2 cUCMSC的免疫表型分析Note：A.Negative expression of CD34；B.Positive expression of CD29；C.Positive expression of CD44；D.Positive expression of CD90.Fig.2 Immunophenotype analysis of the cUCMSC

本研究結果表明：一只健康足月剖宮產胎猴，一次可以獲得5 cm長的臍帶，剪碎后采用貼壁培養方法，可以分離到大量貼壁生長的成纖維細胞樣細胞，流式分析結果顯示這些細胞高表達 CD29、CD44、CD90，體外誘導分化實驗證實這些細胞可以分化為脂肪、骨和軟骨細胞，這些結果與任振華等報道的結果［3］一致。根據間充質干細胞的鑒定標準［8］，可以判定這些貼壁生長的細胞就是cUCMSC。從這些實驗結果可以看出：一次獲得5 cm長的食蟹猴臍帶組織，遠遠超過骨髓采集途徑獲得的組織數量，在短期內可以擴增獲得足夠數量的干細胞，相對于cBMMSC而言，這是cUCMSC最大的優勢所在。比如在干細胞靜脈輸注治療安全評價等實驗研究［9］中，需要在5周之內為1只體重5 kg的食蟹猴準備5×107的干細胞，這對干細胞安全評價試驗提出了很高的要求，如果采用本研究建立的cUCMSC分離培養方法，很容易達到實驗要求。其次，cUCMSC不像cBMMSC那樣容易受到供體年齡的限制［3，5］，臍帶組織含有胚胎發育過程中遺留的大量原始干細胞、通過分離擴增可以獲得Oct-4、Nanog等抗原標志陽性的多潛能干細胞已經得到研究證實［10-12］，這些Oct-4、Nanog陽性的干細胞具有更大的分化潛能，被認為是組織修復治療真正的干細胞［13］。

綜上所述，本研究證明了cUCMSC是開展再生醫學和組織工程研究更理想種子細胞，同時本研究建立的cUCMSC分離培養方法容易規模化生產，我們已經成功建立了cUCMSC資源庫，可供國內外開展以食蟹猴為研究背景的科技工作者使用研究。

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Isolation and identification of cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells

PANG Rong-qing1，HE Jie1，LI Rui-sheng2，ZHAO Jing1，ZHU Hui1，3，ZHU Xiang-qing1，RUAN Guang-ping1，PAN Xing-hua1
（1.Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province，Kunming General Hospital of PLA Chengdu Military Command，Kunming 650032，China；2.Experimental Research Support Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039；3.Clinical Institute of Kunming Medical University，Kunming 650031）

Objective To establish a method for isolation of cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells.Methods Fresh cynomolgus monkey umbilical cord was directly minced into pasty fine pieces，and the pieces were cultured in tissue flask with DMEM/F12 medium supplemented with 10％ fetal bovine serum.The morphological characteristics of the resulting cells were examined，and their expression of mesenchymal cell surface markers were analyzed by flow cytometry.The multidifferentiation potential was examined in vitro，too.Results The fibroblast-like cells were successfully isolated from the fresh umbilical cord by an adherent culture procedure.These adherent cells expressed mesenchymal markers including CD29，CD44，and CD90，and also could be induced to differentiate into adipocytes，osteoblasts and chondrocytes.Conclusion Mesenchymal stem cells can be isolated from fresh cynomolgus monkey umbilical cord by using an adherent culture procedure.

Umbilical cord；Mesenchymal stem cells；Cynomolgus monkey；Cell culture

李瑞生（1969-），男，博士，副研究員，E-mail：lrsheng@sohu.com；潘興華（1963-），男，博士，主任醫師，E-mail：xinghuapang @aliyun.com。

R33

A

1671-7856（2015）04-0066-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.013

云南省自然基金項目（2011HB050，2013DA004）。

龐榮清（1971-），男，E-mail：pangrq2000@aliyun.com。

2015-02-05

綜述與專論