三轉基因銀屑病小鼠模型建立與表型分析

高 祥，劉 寧，葛文萍，潘 爍，張海濤，張連峰，董 偉

(北京協和醫學院，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021）

三轉基因銀屑病小鼠模型建立與表型分析

高 祥，劉 寧，葛文萍，潘 爍，張海濤，張連峰，董 偉

(北京協和醫學院，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021）

目的尿激酶型纖溶酶激活劑(PLAU）、尿激酶型纖溶酶激活劑受體(PLAUR）和信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3）是參與銀屑病病理發生的重要基因。本文目的是制備皮膚特異性表達PLAU、PLAUR和STAT3三種基因的轉基因小鼠，建立可進行性再現銀屑病病理進程的小鼠模型。方法將PLAU、PLAUR和STAT3基因分別插入牛角蛋白5啟動子(BK5）下游，構建轉基因表達載體，通過顯微注射法建立在皮膚組織同時高表達PLAU、PLAUR和STAT3三種基因的轉基因C57BL/6J小鼠。利用PCR法鑒定轉基因小鼠的基因型，Western blot檢測基因表達水平，HE染色觀察皮膚病理表型。結果 PLAU、PLAUR和STAT3三種基因在選定的轉基因小鼠皮膚組織均有明顯表達;轉基因小鼠與同齡野生型小鼠相比表皮狀態差，炎癥明顯;4月齡的轉基因小鼠真皮變簿，表皮過度角化、棘層增厚，毛囊減少、發育異常、部分毛囊內未見毛干，角化不全區域內可見Munro氏小膿腫，真皮炎細胞浸潤。結論建立了穩定傳代的皮膚特異性表達PLAU、PLAUR和STAT3基因的轉基因小鼠品系，轉基因小鼠具有進行性的銀屑病表型，可以作為多病因綜合銀屑病小鼠模型。

銀屑病;信號傳導與轉錄激活因子3;尿激酶型纖溶酶激活劑;轉基因小鼠

銀屑病(牛皮癬，psoriasis）是一種以表皮過度增生和真皮慢性炎癥反應為特征的常見皮膚病。白色人種發病率較高約為2%～5%，黃種人發病率較低約為0．5%，難根治，易復發。目前發病原因不明，與呼吸道感染，胃炎，飲食習慣，精神緊張、憂慮，不當使用激素藥物等有關。有兩方面的病理特征，一方面是真皮慢性炎癥反應，包括T細胞、中性粒細胞浸潤，炎癥因子：比如IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－23分泌增加等［1－2］。另一方面，是表皮過度增生，包括一些與表皮增生相關的血纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA），雙調蛋白(AREG）等高表達［3－4］。銀屑病是人類特有的一類疾病，在動物中少見，銀屑病動物模型的制作主要采用化學制劑誘導，基因修飾或組織移植等方式制備，可以在一定程度上模擬銀屑癬的病理表型、慢性炎癥等［4－7］，但是各有優缺點，銀屑病藥物評價需要一種既有表皮過度增生因素又有慢性炎癥因素參與的多病因動物模型的研發。

信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT轉錄因子家族的一員，JAK/STAT信號通路是大部分細胞因子，包括IL2、IL7、IL12、IL10、IL21等發揮生物學作用的核心通路，STAT3調控CD4+T細胞、CD8+T細胞、Th17、Treg細胞和B細胞等多種淋巴細胞的分化與成熟，與炎癥關系密切［8］。STAT3參與皮膚傷口的愈合、角質細胞遷移、毛囊生長、抵抗皮膚的放射損傷等，皮膚轉基因表達活化的STAT3可引發類似銀屑病的病變，而抑制STAT3表達可以改善銀屑病癥狀［9］，推測，STAT3參與表皮過度增生和真皮慢性炎癥過程，也是重要的治療靶點之一。

血纖維蛋白溶酶原，血纖維蛋白溶酶，抑制因子，激活因子細胞受體是一個多基因成員參與的體系，調節細胞外基質的水解與細胞外基質信號，參與血管生成、腫瘤發生、皮膚發育等多種過程［10］。尿激酶型纖溶酶激活劑(plasminogen activator，urokinase，PLAU）是多種血纖維蛋白溶酶原的激活因子，PLAU和 PLAU受體(plasminogen activator，urokinase receptor，PLAUR，）也叫做UPAR或CD87，都在皮膚組織表達［11－12］。PLAU/PLAUR表達升高可能是銀屑病發生的重要原因［12］。

本文利用轉基因技術，將 STAT3、PLAU和PLAUR同時轉入小鼠基因組，建立皮膚特異表達三種基因的轉基因小鼠，小鼠表現毛囊發育異常、表皮過度增生和慢性炎癥，可以作為多病因綜合小鼠銀屑病。

1 材料和方法

1.1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達載體的構建及轉基因

人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三個基因的cDNA購買自Origene公司，用PCR的方法克隆三種基因的開放閱讀框，并在兩端引入酶切位點KpnⅠ(寶生物工程有限公司中國）和EcoRV(寶生物工程有限公司中國），插入pMD－18T Simple Vector(寶生物工程有限公司中國），測序證實序列正確。以KpnⅠ和EcoRV進行酶切回收三種基因片段，均插入牛角蛋白5(bovine keratin 5）啟動子下游構建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達載體。構建成功后，再用SalⅠ(寶生物工程有限公司中國）將其線形化。調整轉基因片段濃度至4 ng/μL，用顯微注射法(TE2000－U顯微注射儀）將線性化的三種混合后的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備三轉基因小鼠［13］。C57BL/6J小鼠購自北京維通利華生物技術有限公司【SCXK(京）2014－0001】。實驗室使用許可【SYXK(京）2013－0004】。實驗中涉及動物的操作程序已經得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ILAS－GC－2015－002。

1.2 PCR鑒定三轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在9～14日齡時用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA，利用特異引物通過PCR法進行檢測。PCR反應條件：鼠尾DNA模板10～100 ng，PLAU基因上游引物5’GGGCAGCACTGTGAAATAGATAAG下游引物為5’CCCAGGTAGACGATGTAGTCCTC;PLAUR基因上游引物為5’GATTGCCGTGTGGAAGAGTG下游引物為5’TCAGGAAGTGGAAGGTGTCG;STAT3基因上游引物為5’GAGAGTCAAGACTGGGCATATGC下游引物為5’CCAGCTCACTCACAATGCTTCTC。PCR反應體系20 μL(試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環。目的基因片段分別為 PLAU基因545 bp，PLAUR基因475 bp，STAT3基因550 bp。

1.3 Western blot檢測鑒定三種基因的表達

提取三轉基因小鼠與同齡野生型小鼠皮膚總蛋白，進行SDS－PAGE凝膠電泳，蛋白轉移至NC膜上(Millipore美國），置于5%脫脂奶粉封閉液，分別用兔抗人PLAU抗體(Abcam）、兔抗人PLAUR抗體(Abcam）、鼠抗鼠STAT3抗體(Cell Signaling）檢測基因的表達水平。采用辣根過氧化物酶(Hrp）－耦聯的羊抗兔抗體和羊抗鼠抗體結合一抗(Pierce，USA），用Hrp－耦聯的鼠抗β－actin單克隆抗體做為內參(康成生物，中國）。

1.4 轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的大體觀察

選用同齡同性別的轉基因陽性小鼠和野生型小鼠，SPF級動物房，同等條件正常飼養，定期觀察兩組小鼠表皮毛發生長情況，并拍照記錄。

1.5 HE染色觀察4月齡轉基因小鼠與同齡野生型小鼠的皮膚組織

選用4月齡的轉基因陽性和同齡野生小鼠，取小鼠背部及腹部皮膚，固定在10%中性甲醛中48 h，進行修塊、脫水、包埋、切片、HE染色和鏡下觀察(Nikon顯微鏡，日本和 Leica MZ16F體視鏡，德國）［14］。

2 結果

2.1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因表達載體的構建

用PCR克隆的人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因，測序結果表明同已報道的序列完全一致(PLAU Gene ID：5328，NM－002658;PLAUR Gene ID：5329，NM－002659;STAT3 Gene ID：20848，NM－011486;）。將三種基因分別插入皮膚特異的表達啟動子BK5下游，構建人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因三種轉基因載體(圖1）。

2.2 三轉基因小鼠基因型的鑒定

用顯微注射法將線性化的轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉入到假孕受體ICR小

鼠中，小鼠出生后9～14 d提取基因組DNA，用PCR擴增目的基因片段來檢測轉基因小鼠，三種目的基因片段分別為PLAU基因545 bp，PLAUR基因475 bp，STAT3基因550 bp(圖2），共得到3只首建鼠均可傳代。

圖1 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3基因轉基因表達載體Fig．1 PLAU，PLAUR，STAT3 transgenic construct

圖2 PCR鑒定轉基因小鼠基因型Note：P，positive control;N，negative control;W，blank control; M，DNA molecular weight marker;Lane 1，4，7 the positive transgenic mice;Lane 2，3，5，6，8 negative．Fig．2 Genotyping the transgenic mice by PCR

2.3 人PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的表達

首先用Western blot分析3個系1月齡的轉基因小鼠皮膚中人PLAU，PLAUR及鼠STAT3的表達情況，結果顯示三種蛋白在皮膚中均有表達，表達量各有差別(圖3），選取三種基因均有較高表達水平的TG7保種繁殖，并進行下一步實驗。

2.4 轉基因小鼠與同齡野生型小鼠表皮差異

先用Western blot結果顯示TG4皮膚中主要高表達PLAU和STAT3，而TG7皮膚中PLAU，PLAUR和STAT3均高表達。和TG4小鼠比較TG7小鼠表型更明顯，說明三種基因同時表達對病理發生是關鍵。TG7小鼠在1月齡就表現腹部毛發稀疏，無光澤，表皮粗糙，至4月齡表現典型腹部皮膚紅腫和炎癥(圖4）。皮膚炎癥主要表現在腹部，背部表型不明顯。除皮炎表型外，小鼠生育和發育無異常。

注：WT：野生型小鼠;TG1、TG4、TG7：轉基因小鼠;內參：β－actin。

圖4 轉基因小鼠表皮表型Fig．4 The phenotype of the transgenic mouse

2.5 皮膚病理表型(圖見彩插1）

選用4月齡的轉基因陽性和同齡野生小鼠，采取頸椎脫臼法犧牲，取背部及腹部皮膚，HE染色，鏡下觀察顯示，轉基因小鼠真皮變簿(圖5A），表皮過度角化和棘層增厚(圖5B），毛囊減少和發育異常，部分毛囊內未見毛干(圖5C），角化不全區域內可見中性白細胞構成的小膿腫(Munro氏小膿腫）和真皮炎細胞浸潤((圖5D）。

3 討論

真皮慢性炎癥反應和表皮過度增生是銀屑病的2個典型的病理特征，參與銀屑病的病理發生因素很多，如T細胞、中性粒細胞浸潤，炎癥因子分泌增加［1－2］，一些與表皮增生相關的因子表達增多，如tPA，AREG，STAT3，PLAU，PLAUR［3－4，11－12］。利用一些具有刺激和損傷作用的化學物質對動物皮膚進行處理，比如，可以用 10%十二烷基硫酸鈉(SDS）涂抹小鼠背部皮膚造成銀屑病樣體征，但是這種模型一方面病理發生機制與銀屑病病理發生機制差別較大，主要局限于病理表型的模仿;另一方面，在移出化學物質后，動物會自行痊愈，沒有漸進性的特點，留給藥物治療的觀察時間也比較短。通過轉基因的方式在皮膚局部表達參與銀屑病發生的一些基因，可以在病因和病理發生過程方面更好的模仿銀屑病。針對參與銀屑病發生的一些基因單獨轉基因有時候并不能引發皮膚銀屑病樣體征，比如，Wnt5a基因在銀屑病發病過程高表達，但是在皮膚轉基因表達Wnt5a只觀察到毛囊發育異常，而沒有銀屑病樣體征［15］。所以，將多種相關基因一起轉基因可以整合多種病因的作用，更真實的模仿銀屑病。

PLAU，PLAUR和STAT3都是參與銀屑病病理發生的重要基因［9，11－12］。牛角蛋白 5啟動子(BK5）是常用的皮膚組織特異表達的啟動子［16］。本文利用BK5啟動子驅動PLAU，PLAUR和STAT3的表達，建立了在皮膚中同時表達這三種基因的轉基因小鼠(圖1－3）。和野生型小鼠相比，轉基因小鼠在1月齡就表現腹部毛發稀疏，無光澤，表皮粗糙，至4月齡表現典型腹部皮膚紅腫和炎癥(圖4）。轉基因小鼠真皮變簿，表皮過度角化和棘層增厚，毛囊減少和發育異常，角化不全區域內可見中性白細胞構成的Munro氏小膿腫和真皮炎細胞浸潤(圖5）。轉基因小鼠在病因、炎癥和皮膚損傷三方面都能表現銀屑病特征，并且具有累進性的特點，可以作為多病因綜合銀屑病小鼠模型。

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Establishment of the psoriasis transgenic mouse model and analysis of the phenotype

GAO Xiang，LIU Ning，GE Wen－ping，PAN Shuo，ZHANG Hai－tao，ZHANG Lian－feng，DONG Wei
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective To develop a model that could copy the pathological development of psoriasis，the tripletransgenic mice that harboring Plasminogen activator，urokinase(PLAU），PLAU receptor(PLAUR）and signal transducer and activator of transcription 3(STAT3）were generated．They are the important genes involved in the pathological development of psoriasis．Methods The transgenic plasmid was constructed by insertion of the PLAU，PLAUR and STAT3 into the downstream bovine keratin 5 promoter respectively．The transgenic mouse was produced by microinjection and the genotyping was detected by PCR．The expression level of the transgenic gene was determined by Western blotting．The pathological changes were observed by HE staining．Results One mouse line was selected with over expression of the PLAU，PLAUR and STAT3 in the tissue of skin．The transgenic mice showed decreased dermal layer，a hyperkeratinized cuticular layer and increased stratum spinosum．The number of hair follicle was reduced and developed abnormally in the transgenic mice．The Munro abscess in the dermal layer and the increased inflammatory cell infiltrates in dermal layer werealso observed in the transgenic mice．Conclusions A transgenic mouse line was produced and passage stably，which expressed the PLAU，PLAUR and STAT3 in the tissue of skin and developed the psoriasis progressively．All of our results suggested that the transgenic mice were a useful animal model for psoriasis．

Psoriasis;Signal transducer and activator of transcription 3;Plasminogen activator urokinase; Transgenic mice

R－332

A

1671－7856(2015）07－0011－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．003

國家科技支撐計劃課題“基因工程大鼠模型的研發與示范”(2014BAI02B01）。

2015－06－05