衰老對小鼠肺干細胞修復能力的影響

朱栩棟，姚 超，龔松迪，何立鋒，李曉燕，張玲玲

(杭州師范大學，杭州311121）

衰老對小鼠肺干細胞修復能力的影響

朱栩棟，姚 超，龔松迪，何立鋒，李曉燕，張玲玲

(杭州師范大學，杭州311121）

目的 研究衰老對小鼠肺組織干細胞在生理狀態和支氣管上皮細胞(Clara細胞）損傷后修復能力的影響。方法通過流式細胞術對老齡和低齡組小鼠的肺組織干細胞比例進行分析，研究衰老對肺組織干細胞穩態維持的影響;通過免疫組化染色對肺組織病理切片進行分析，確立支氣管上皮細胞(Clara細胞）損傷模型;通過流式細胞術、免疫組化染色、肺組織病理切片研究老齡和低齡組小鼠在支氣管上皮細胞(Clara細胞）損傷后肺組織干細胞的損傷修復能力。結果 老齡組肺組織干細胞比例(肺上皮干細胞/前體細胞，肺間質干細胞/前體細胞）在穩態維持的情況下較低齡組改變不顯著;在肺支氣管上皮細胞(Clara細胞）損傷后，老齡組小鼠支氣管上皮出現較嚴重的細胞受損;在接下來的觀察中發現，小鼠肺組織前體細胞/肺組織總細胞比例在老齡組顯著下降，且增殖細胞在肺組織前體細胞和肺組織干細胞中的比例出現顯著下降;同時，小鼠支氣管上皮恢復程度在老齡組明顯較差。結論在穩態維持的狀態下，衰老對肺組織干細胞的比例沒有影響。在支氣管上皮細胞受到損傷后，肺組織干細胞占肺總細胞比例降低，修復與再生能力顯著下降。可能為臨床上衰老更易產生肺組織損傷及病變更嚴重的原因。

肺損傷修復;衰老;流式細胞術;肺干細胞

在我國，呼吸系統疾病的致死率僅次于心腦血管和惡性腫瘤，位居我國居民死亡原因的第三位。人口老齡化是影響呼吸系統疾病發生的重要因素。肺干細胞在肺組織損傷修復和穩態維持中發揮重要作用［1－3］。呼吸系統疾病發生時可能存在著肺干細胞增殖分化和穩態維持的失衡［1，4］。在衰老過程中，肺組織的形態結構發生改變，通氣功能逐漸減弱，但是衰老是否影響了肺干細胞的穩態維持和損傷修復能力尚不清楚。

小鼠的肺組織由多種細胞組成，其中上皮細胞包括基底細胞、纖毛細胞、杯狀細胞、刷細胞、小顆粒細胞、Clara細胞、Ⅰ型肺泡上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞和神經內分泌細胞等。Clara細胞被認為是遠端支氣管上皮的一種主要細胞，主要分布在小鼠的遠端細支氣管上皮。Clara細胞占小鼠支氣管上皮細胞數目的89．5%，人類的終末細支氣管上皮細胞的(11±3）%，人類呼吸性細支氣管上皮細胞的(22±5）%，隨著支氣管內徑的減小，其比例逐漸增多［5］。

肺臟具有一定程度的再生能力，在肺損傷發生時可通過局部的修復來維持組織的結構和功能。這是由肺干細胞在損傷后進一步分化、增殖，替代受損傷的細胞，維持著肺上皮組織的穩定。參與肺組織的再生和損傷修復的肺干細胞主要存在兩種類型：肺上皮干細胞和肺間質干細胞。我們利用萘特異性損傷Clara細胞，建立支氣管上皮細胞損傷模型。觀察肺組織干細胞對年輕和衰老兩種狀態下在支氣管上皮細胞損傷后的穩態維持能力。由于目前尚無公認的肺干細胞表面標記，對肺組織干細胞的來源亦是眾說紛紜［2］。近幾年來，研究人員利用流式細胞分析技術對肺組織干細胞進行分析和分選，極大地方便了對肺衰老和組織損傷修復過程的研究［6－8］。因此，本研究中利用流式細胞技術觀察衰老過程中肺組織干細胞數量和構成的改變，觀察肺支氣管上皮細胞損傷模型修復過程中肺干細胞的改變，了解衰老對肺組織干細胞在肺支氣管上皮細胞損傷修復中的影響。

1 材料和方法

1.1 肺組織單細胞懸液的制備：

根據文獻報道，制備肺組織單細胞懸液［6］，每個樣品準備1 mg/mL膠原酶Ⅰ溶于無菌的PBS中，預熱至37℃。脫頸處死小鼠，打開腹腔，下腔靜脈放血。打開胸腔，取肺，放入裝有冷的PBS的15 mL離心管中。在這一步驟中，將肺部的支氣管去除，只留下肺的遠端細胞。在離心管中輕輕攪動肺葉，去除多余的血液直至肺組織變白，用眼科剪將肺剪碎，剪碎的組織放入15 mL離心管內，加入預熱的3 mL膠原酶溶液。將離心管放在thermo的混勻器上750 r/min，37度震蕩0．5 h。5 mL注射器吹打懸液，使大塊結締組織分離，在混勻器上750 r/min，37度繼續震蕩0．5 h，1 mL注射器吹打懸液，使細胞分離，0．22 μm濾膜過濾，制備單細胞懸液，1400 r/min離心5 min，加入1 mL紅細胞裂解液，去除紅細胞。

1.2 肺干細胞流式分析

根據文獻報道的研究方法［6，9］，以 CD31－CD45－Sca－1+CD34+作為肺干細胞的表面標記，CD31－CD45－Sca－1+CD34+EpCAM－作為肺間質干細胞標記;CD31－CD45－Sca－1+CD34+EpCAM+作為肺上皮干細胞標記。將 CD31－Biotin，CD45－Biotin，SA－PE/FITC，Sca－1－PE－Cy7抗體用稀釋液10倍稀釋;肺組織細胞懸液離心后去上清，保留終體積約50 μL。加入CD31－Biotin(1－10）10 μL，CD45－Biotin(1－10）10 μL，冰上孵育30 min;加入抗體稀釋液2 mL，1500 r/min離心5 min;去上清，終體積50 μL。加入SA－PE(1－10）15 μL，Sca－1－PE－Cy7(1－10），APC－Epicam(1－10）稀釋液10 μL，CD34－FITC 3μL冰上孵育45 min;加入稀釋液2 mL，用50 μm濾膜過濾，1500 r/min離心，5 min;去上清，加入抗體稀釋液300 μL混勻;利用流式細胞儀分析肺上皮干細胞的比例。

1.3 萘致肺Clara細胞損傷模型的制備

我們將C57 BL/6J野生型小鼠根據年齡分為兩組，老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡），每組8只。對年輕和年老組小鼠給予275 mg/kg萘(用玉米油溶解）腹腔注射，同年齡對照組小鼠給予等體積的玉米油腹腔注射。3～7 d后取小鼠肺組織實驗。SPF級C57 BL/6J小鼠，來源于杭州師范大學實驗動物中心【SCXK(浙）2011－0048】。萘致肺Clara細胞損傷模型構建在杭州師范大學醫學實驗中心進行【SYXK(浙）2011－0157】。

1.4 蘇木素-伊紅染色

將小鼠脫頸處死，分離肺組織取右下肺葉，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋。進行連續石蠟切片，厚度5 μm。切片固定到載玻片上。切片脫水后，進行蘇木素伊紅染色。

1.5 免疫熒光染色：

將小鼠脫頸處死，分離肺組織取右下肺葉，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后石蠟包埋。進行連續石蠟切片，厚度5 μm。切片固定到載玻片上。對石蠟切片進行胞內抗原CCSP染色，觀察肺損傷修復過程中Clara細胞的形態結構［10］。

1.6 統計學分析

數據用均數 ±標準誤表示，組間比較采用student t檢驗。

2 結果

2.1 衰老對小鼠肺組織干細胞比例的影響

為研究衰老狀態是否會影響小鼠遠端肺干細胞占肺總細胞的比例，我們對遠端肺干細胞在老齡組和低齡組的比例進行了分析(圖1A－B）。分離肺組織，采用CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+標記肺上皮干細胞，流式細胞儀分析比例。結果表明肺上皮干細胞(CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+）(老齡組37．02%±6．58%，低齡組36．12% ±0．61%）和肺間質干細胞(CD31－CD45－Sca－1+EpCAM－）(老齡組10．46%±4．36%，低齡組9．85%±2．31%）在肺總細胞中所占比例在老齡組和低齡組之間無顯著差異。另據文獻報道，EpCAMhi標記細胞屬于上皮干細胞，將其進行體外培養，可生成上皮細胞樣克隆球［11］。根據該文獻，我們將 EpCAM+(CD31－CD45－Sca－1－EpCAM+）細 胞 分 為 EpCAMhi，EpCAMmed，EpCAMlow三群 (圖1A）。其中EpCAMhi(老齡組 4．75% ±1．23%，低齡組 4．81% ± 4．72%），EpCAMmed(老齡組22．5%±4．98%，低齡組19．78%±0．97%），EpCAMlow(老齡組9．18%± 1．13%，低齡組12．29%±3．26%）細胞群并未在衰老組中出現顯著差異(P＞0．05）(圖1B）。說明在正常生理穩態下，衰老并不影響在遠端肺組織中干細胞的比例。

2.2 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的建立及肺組織干細胞修復能力的觀察

2．2．1 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的建立

利用Clara細胞的萘易損傷的特性，建立小鼠的支氣管上皮細胞特異性損傷模型。對小鼠進行萘的腹腔注射，在支氣管氣道上皮中可選擇性地去除表達CCSP的Clara細胞。萘處理3 d后的肺組織進行HE染色，觀察標本，可見Clara細胞在細支氣管上皮形成空泡，部分部位出現脫落。上皮結構受到破壞，不完整，有斷裂出現(彩插3圖2）。

2．2．2 肺支氣管上皮損傷小鼠模型的修復能力

萘損傷7 d后，觀察肺支氣管上皮是否進行了修復，可見Clara細胞的萘特異性損傷依然存在，同時出現部分修復(彩插3圖3）。

圖1 年輕、年老小鼠遠端肺組織干細胞的比例比較Note：(A）The FSC schematic diagram．(B）Comparison of the proportion of lung stem cells between young and old group．EpCAMhimeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMhicells to total lung cells;EpCAMmedmeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMmedcells to total lung cells;EpCAMlowmeans the proportion of CD31－CD45－Sca－1+EpCAMlowcells to total lung cells;EpCAM+(lung epithelial stem cells/total lung cells）：CD31－CD45－Sca－1+EpCAM+cells to total lung cells;Sca－1+(lung mesenchymal stem cells/total lung cells）：CD31－CD45－Sca－1+EpCAM－cells to total lung cells．OLD：old group(n=8），YOUNG：young group(n=8）．Fig．1 The number of lung stem cells in total distal lung cell in young and old group mice

2.3 衰老對支氣管上皮損傷損傷修復的影響(圖見彩插4）

2．3．1 年輕和年老萘損傷模型的肺組織病理改變

將C57BL/6J小鼠分為老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡），每組各8只。進行萘的腹腔注射(200 mg/kg）。將肺組織的石蠟切片進行HE染色(圖4A－D）。細支氣管上皮細胞在老齡對照組(未經萘處理組）(圖4B）較低齡組(圖4A）變薄，在上皮細胞中未觀察到脫落及死亡。在萘損傷組中，(圖4C－D）我們發現細支氣管上皮細胞出現部分脫落及破壞，間隙變大;老齡組(圖4D）肺上皮細胞大部分出現脫落，破壞嚴重;低齡組(圖4C）則表現較輕，具體為細胞間隙增大，少量脫落。對肺組織進行免疫熒光染色，CCSP特異性標記細支氣管上皮(Clara細胞）細胞(圖4E－H）。染色顯示萘可特異性損傷支氣管上皮Clara細胞。老齡組損傷更明顯(圖4H），3 d后即可看到大部分Clara脫落，死亡。甚至細支氣管上皮層出現結構破壞;與此同時，低齡組Clara細胞仍可見。(圖4G）。

2．3．2 年輕和年老小鼠肺支氣管上皮損傷修復過程中肺干細胞的分析

肺支氣管上皮損傷模型建立后，我們對遠端肺干細胞在老齡和低齡組中的的比例進行了分析。具體如下，老齡組(＞72周齡）和低齡組(8～16周齡）的C57 BL/6J野生型小鼠各8只，萘處理特異性損傷肺支氣管上皮細胞。用CD31－CD45－Sca－1+CD34+對在處理7 d的小鼠肺組織進行上皮干細胞表面標記，同時用BrdU標記增殖細胞，并在流式細胞儀上進行分析(圖5）。結果顯示萘處理后老齡組較低齡組小鼠肺前體細胞(CD31－CD45－）/肺總細胞比值(老齡組12．24%±2．53%，低齡組18．74% ±2．05%）及肺組織干細胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）/肺總細胞比值(老齡組0．89% ±0．13%，低齡組1．38%±0．15%）均出現顯著降低。無論是肺前體細胞(CD31－CD45－）(老齡組 8．21% ± 1．46%，低齡組12．57%±1．59%）還是肺組織干細胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）(老齡組6．85% ± 0．46%，低齡組8．57%±0．89%）中增殖細胞所占比例低齡組明顯高于老齡組(P ＜0．05）。該數據提示損傷后，低齡組的干細胞增殖能力在修復過程中較老齡組高。

圖5 A．肺支氣管上皮損傷后老齡組和低齡組肺前體細胞(CD31－CD45－）和肺組織干細胞(CD31－CD45－Sca－1+ CD34+）占肺組織總細胞比例;B．肺支氣管上皮損傷后老齡組和低齡組肺前體細胞(CD31－CD45－）中增殖細胞和肺組織干細胞(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）中增殖細胞所占比例。OLD為老齡組(n=8），YOUNG為低齡組(n=8）;*為P＜0．05Fig．5 A．The proportion of progenitor cells(CD31－CD45－）;lung stem cells(CD31－CD45－Sca－1+CD34+）to total lung cell in different ages mice after naphthalene treatment．B．The proportion of BRDU positive cell in CD31－CD45－Sca－1+CD34+ and CD31－CD45－Sca－1+CD34+cell．OLD：the old group(n=8）;YOUNG：the young group(n=8）．*：P＜0．05

3 討論

肺組織衰老的發生過程和衰老過程中肺臟相關的各種疾病的致病機制仍有待深入研究。成體干細胞在組織再生中具有重要作用，越來越多的研究表明衰老與干細胞功能的下降密不可分［12－15］。隨著干細胞生物學方法的建立，關于其研究也在不斷深入。在肺臟相關疾病及損傷修復過程中肺組織干細胞所扮演的角色也越來越受到人們的重視。肺干細胞的體外培養為相關疾病的發生發展體外研究提供了模型，并為干細胞在肺相關疾病的治療提供了理論基礎［3］。但肺干細胞由于標記物不明確而延緩了其相關的研究，研究報道表明肺間質和上皮干細胞可以使用流式細胞術進行篩選［6］。根據文獻報道我們采用流式細胞術對肺干細胞進行了表面標記。研究在衰老變化中成體肺組織干細胞的自我更新和分化能力，以期探討成體干細胞在肺組織器官的衰老和衰老相關疾病的發生中的作用。

在生理狀態下，肺干細胞擁有有限的增殖能力，為了發掘肺干細胞的增殖潛力，我們建立了肺上皮細胞損傷模型。萘能夠特異性損傷小鼠支氣管上皮Clara細胞，我們利用該動物模型來研究肺干細胞在肺衰老生理狀態及肺上皮細胞損傷過程中再生修復能力。研究顯示衰老在生理狀態下對肺干細胞(包括遠端肺上皮干細胞和肺間質干細胞/肺總細胞）的比例影響不明顯。而在小鼠肺支氣管上皮(Clara）細胞特異性損傷修復過程中，肺上皮干細胞和肺間質干細胞/肺總細胞的比例出現下降。為了進一步比較損傷修復狀態下年輕和年老小鼠肺組織干細胞修復能力的差異，我們通過BrdU染色對肺組織干細胞的增殖能力進行了分析，發現老齡組較低齡組的肺干細胞增殖比例下降，表明在衰老顯著影響了肺上皮細胞損傷后肺干細胞修復的能力。由此可見，在正常生理狀態下衰老對以肺干細胞比例為代表的肺干細胞表型沒有影響，而一旦在應激狀態下(Clara細胞受損）肺干細胞不僅出現比例下降的表型且增殖能力也存在明顯的減弱趨勢。該研究發現揭示了衰老狀態下肺組織干細胞尚能保持穩態維持，但在損傷后的對肺組織的修復卻無能為力。該發現為肺組織衰老和肺組織干細胞的研究提供了理論依據，并為干細胞在特異性組織器官衰老預防及治療提供了研究思路。

［1］Royce SG，Moodley Y，Samuel CS．Novel therapeutic strategies for lung disorders associated with airway remodelling and fibrosis．Pharmacol Ther 2013．

［2］Kotton DN，Morrisey EE．Lung regeneration：mechanisms，applications and emerging stem cell populations．Nat Med 2014; 20：822－32．

［3］Desai TJ，Brownfield DG，Krasnow MA．Alveolar progenitor and stem cells in lung development，renewal and cancer．Nature 2014;507：190－4．

［4］LeeJH，BhangDH，BeedeA，etal．Lungstem cell differentiation in mice directed by endothelial cells via a BMP4－NFATc1－thrombospondin－1 axis．Cell 2014;156：440－55．

［5］Boers JE，AmbergenAW，ThunnissenFB．Numberand proliferation of clara cells in normal human airway epithelium．Am J Respir Crit Care Med 1999;159：1585－91．

［6］Bertoncello I，McQualter J．Isolation and clonal assay of adult lung epithelial stem/progenitor cells．Curr Protoc Stem Cell Biol 2011;Chapter 2：Unit 2G 1．

［7］Ding BS，Nolan DJ，GuoP，etal．Endothelial－derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization．Cell 2011;147：539－53．

［8］Kajstura J，Rota M，Hall SR，et al．Evidence for human lung stem cells．N Engl J Med 2011;364：1795－806．

［9］Kim CF，Jackson EL，Woolfenden AE，et al．Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung cancer．Cell 2005;121：823－35．

［10］Rock JR，Barkauskas CE，Cronce MJ，et al．Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition．Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108：E1475－83．

［11］McQualter JL，Yuen K，Williams B，et al．Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung．Proc Natl Acad Sci U S A 2010;107：1414－9．

［12］Liu J，Finkel T．Stem cell aging：what bleach can teach．Nat Med 2006;12：383－4．

［13］Oh J，Lee YD，Wagers AJ．Stem cell aging：mechanisms，regulators and therapeutic opportunities．Nat Med 2014;20：870－80．

［14］Beerman I，Bock C，Garrison BS，et al．Proliferation－dependent alterations of the DNA methylation landscape underlie hematopoietic stem cell aging．Cell Stem Cell 2013;12：413－25．

［15］Beerman I，Seita J，Inlay MA，et al．Quiescent hematopoietic stem cells accumulate DNA damage during aging that is repaired upon entry into cell cycle．Cell Stem Cell 2014;15：37－50．

Effect of aging on repair capability of lung stem cells

ZHU Xu－dong，YAO Chao，GONG Song－di，HE Li－feng，LI Xiao－yan，ZHANG Ling－ling
(Hang Zhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

Objective To study the impact of aging on the capability of lung stem cell steady－state maintaining and bronchial epithelial cells regeneration and differentiation during the repair of lung epithelial cells after naphthalene induced bronchial epithelialium injury．Methods The proportion of lung stem cells in mice after naphthalene treatment was analyzed by immunohistochemistry and FACS．The repair efficiency of lung epithelial cell in young and old mice was examined by immunohistochemistry staining and FACS．Results The data suggested that aging didn’t change the proportion of lung stem cells(including the distal lung epithelial stem cells/progenitor cells and lung mesenchymal stem cells/progenitor cells）under normal physiological conditions．After naphthalene injury，more serious injury and decreased repairing capacity was observed in old group．Lung progenitor cells/total lung cells decreased during the repair process of lung bronchial epithelialium(clara cell）injury．The ratio of regenerated cell to lung progenitor and stem cells were also significantly decreased in old group．Conclusion The regenerated capability of lung stem cells after lung bronchial epithelialium injury decreased with aging．This might be the reason of more incidence of lung injury and worse therapeutic results in the elder in clinic．

Lung damage and repair;Aging;FACS;Lung stem cell

R－332

A

1671－7856(2015）07－0025－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．006

國家自然科學基金(81300264）;2012年度浙江省大學生科技創新活動計劃(新苗人才計劃2012R4210007）。

朱栩棟(1987－），男，講師。

張玲玲(1982－），女，講師，博士，研究方向：衰老與成體干細胞。E－mail：zhangll821025@163．com。

2015－07－02