丹參水提物對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

·實(shí)驗(yàn)研究·

丹參水提物對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

本文研究丹參水提物對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。以乳鼠心室肌進(jìn)行心肌細(xì)胞培養(yǎng)并建立缺氧-復(fù)氧損傷模型， 檢測(cè)不同濃度丹參水提物預(yù)處理后細(xì)胞的存活率， 乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）的泄漏量及Akt的磷酸化水平。丹參水提物對(duì)缺氧-復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用， 這可能與它激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

缺氧-復(fù)氧；心肌細(xì)胞；丹參水提物

丹參是著名的傳統(tǒng)中藥， 具有抗氧化、改善微循環(huán)防止血栓形成等多種功能， 近年來又發(fā)現(xiàn)丹參可促進(jìn)骨愈合［1］、預(yù)防股骨頭壞死［2］、有效降低絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松血中骨吸收生物指標(biāo)［3］。但是丹參水提物對(duì)缺氧-復(fù)氧乳大鼠心肌細(xì)胞是否有保護(hù)作用研究不多， 本研究旨在采用缺氧-復(fù)氧乳大鼠心肌細(xì)胞損傷模型， 探討丹參水提物對(duì)缺氧-復(fù)氧心肌細(xì)胞保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制， 為其在臨床上防治心肌缺血、缺氧性疾病提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參水提物在試驗(yàn)室自制。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1～3 d的 SD大鼠心肌組織，按文獻(xiàn)［4］進(jìn)行分次水浴攪拌消化， 差速貼壁法純化心肌細(xì)胞， 以1×106/cm2的細(xì)胞密度接種于35 mm2培養(yǎng)皿。

1.3 心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型的建立和分組 不含血清的DMEM低糖培養(yǎng)基， 純氮1 L/min流量充分飽和30 min， 用上述培養(yǎng)基置換正常培養(yǎng)基， 將細(xì)胞放入密封袋充入高純度氮?dú)猓?密封放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)為缺氧；用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液置換培養(yǎng)基， 置于95%O2+5%CO2， 培養(yǎng)箱常氧培養(yǎng)為復(fù)氧。

細(xì)胞分為五組：正常組；缺氧-復(fù)氧模型組；丹參水提物組［分別在培養(yǎng)基中加入丹參水提物（0.2或0.4 g/L）， 其余操作同缺氧-復(fù)氧模型組］；LY294002組［在培養(yǎng)基中加入LY294002（30 μmol/L）， 其余操作同缺氧-復(fù)氧模型組］。

1.4 LDH、CK和AST活力測(cè)定 LDH、CK和AST活力用試劑盒測(cè)定。

1.5 Akt和p-Akt蛋白表達(dá)采用Biorad 法取總蛋白20 μg進(jìn)行電泳分離蛋白。蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜， 3%BSA 液 4℃封閉過夜， 分別加入Akt和p-Akt單克隆抗體（1∶150稀釋），4℃孵育過夜， 辣根過氧化物酶山羊抗兔 lgG 二抗孵育1 h，DAB 顯色照相。用 image J 軟件分析條帶的積分光密度值，相對(duì)蛋白含量用積分光密度值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 實(shí)施t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 實(shí)施χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 與正常組比較， 模型組中心肌細(xì)胞的存活率顯著較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與缺氧-復(fù)氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）組心肌細(xì)胞的存活率顯著較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同樣的， 與模型對(duì)照組比較，LY294002（30 μmol/L）能夠減弱丹參水提物提高心肌細(xì)胞的存活的效果， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）， 見表1。

2.2 與正常組比較， 模型組中心肌細(xì)胞中的LDH、CK和AST活力顯著增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與缺氧-復(fù)氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）組心肌細(xì)胞中的LDH、CK和AST活力顯著降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同樣的， 與模型對(duì)照組比較， LY294002（30 μmol/L）預(yù)處理能夠減弱丹參水提物對(duì)心肌細(xì)胞中的LDH、CK和AST活力降低的效果， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）， 見表2。

2.3 與正常組比較， 模型組心肌細(xì)胞中的p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著較低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與缺氧-復(fù)氧模型組比較， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）預(yù)處理均能顯著增加心肌細(xì)胞中的p-Akt蛋白表達(dá)水平， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與丹參水提物（0.4 g/L）+缺氧-復(fù)氧組比較，LY294002（30 μmol/L）能夠降低丹參水提物對(duì)p-Akt蛋白的激活效果， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表1 丹參水提物對(duì)心肌細(xì)胞的存活率的影響（ x-±s， %）

表2 丹參水提物對(duì)LDH、CK和AST活力的影響（ x-±s）

表3 丹參水提物對(duì)AI和p-Akt水平的影響（ x-±s）

3 討論

目前缺血性心臟病的治療方法主要是進(jìn)行心肌再灌注，以改善心肌的血流量， 對(duì)缺血心肌的早期再灌注治療是有益和必不可少的， 可以減輕缺血損傷， 挽救心肌細(xì)胞， 縮小梗死面積［4，5］。因此， 在復(fù)氧期給予抗凋亡干預(yù)可能有助于減少?gòu)?fù)氧所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

利用培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞， 建立缺氧-復(fù)氧模型， 以心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、CK、AST漏出量作為心肌細(xì)胞損傷的指標(biāo)。LDH、CK、AST是心肌細(xì)胞胞內(nèi)酶， 漏出量的多少能反映細(xì)胞膜的受損程度［6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示， 缺氧-復(fù)氧可以引起心肌細(xì)胞中LDH、CK、AST水平明顯增加， 導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率下降， 丹參水提物（0.2或0.4 g/L）和LY294002（30 μmol/L）預(yù)處理均能顯著降低心肌細(xì)胞中的LDH、CK、AST水平， 提高心肌細(xì)胞存活率。

Akt磷酸化可以抑制心肌細(xì)胞的壞死和凋亡， 保護(hù)心肌細(xì)胞， 對(duì)缺血性心臟病的治療具有重要意義［7］， 本研究進(jìn)一步考察了丹參水提物對(duì)缺氧復(fù)氧損傷所致的心肌細(xì)胞Akt磷酸化的影響， 結(jié)果表明丹參水提物可顯著增加心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷所致的 p-Akt蛋白表達(dá)， 這一效果可因Akt抑制劑LY294002的加入來減弱。

綜上所述， 認(rèn)為丹參水提物可以通過激活A(yù)kt的磷酸化，從而保護(hù)心肌缺血再灌注過程中心肌細(xì)胞的損傷。

［1］ 肇毅， 潘立群.丹參促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的研究現(xiàn)狀.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 16（4）:253-254.

［2］ 史風(fēng)雷， 任麗霞， 孫升云， 等.復(fù)方丹參注射液預(yù)防激素股骨頭壞死的初步研究.中醫(yī)正骨， 2002， 14（4）:3-5.

［3］ 李隆敏， 周櫻， 邵幸署， 等.丹參酮防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志， 1996， 2（1）:78-80.

［4］ Jen-HweyChiu， Ya-Fang Cheng， Jir-YouWang， et al.Remotepharmacological preconditioning on median nerve territory increases Hsp32 expression and attenuates ischemia-reperfusion injury in rat heart.Life Sciences， 2012， 90（17-18）:629-639.

［5］ Jianbo Gao， Yi Kang， Jianshi Lou.The Optimal Strategy of Noninvasive Limb Ischemic Preconditioning for Protecting Heart Against Ischemia-Reperfusion Injury in Rats.Journal of Surgical Research， 2012， 174（2）:47-54.

［6］ Jing Guo， Shou-Bao Wang， Tian-Yi Yuan， et al.Coptisine protects rat heart against myocardial ischemia/reperfusion injury by suppressing myocardial apoptosis and inflammation.Atherosclerosis，2013， 231（2）:384-391.

［7］ Krisztina Kovacs， Ambrus Toth， Peter Deres， et al.Critical role of PI3-kinase/Akt activation in the PARP inhibitor induced heart function recovery during ischemia-reperfusion.Biochemical Pharmacology，2006， 71（4）:441-452.

Protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.
Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

To study the protective effect by Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for hypoxia-reoxygenation damage in myocardial cells of suckling mice.The hypoxia-reoxygenation damage model was made from myocardial cells culture of suckling mice.Detection was taken on cells survival rate， leakage rates of lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， aspartate transaminase （AST）， and phosphorylation level of Akt of cells in different concentrations of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract.Salvia Miltiorrhiza aqueous extract provides obviously protective effect for myocardial cells with hypoxia-reoxygenation damage， and that may be related with its activation of PI3K/Akt signal path.

Hypoxia-reoxygenation; Myocardial cells; Salvia miltiorrhiza aqueous extract

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.07.207

2014-11-05］

515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科（張東濤）， 心胸外科（黃偉哲）；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管外科（陳喜珊）