男性不育患者Y染色體微缺失與性激素水平相關(guān)

汪 明，喬 斌，李 雯，李 艷*

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院1.檢驗科;2.血液科，湖北 武漢430060)

大約10%～15%的精子缺陷和男性不育是由遺傳因素引起的，其中Y染色體微缺失是引起男性不育的主要遺傳因素之一，尤其是Y染色體長臂(Yq)端無精子因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)域的微缺失[1]。目前，AZF 劃分為4個互不重疊區(qū)域，即AZFa、AZFb、AZFc 和AZFd，該區(qū)域的缺失和性激素水平均影響男性的正常生精功能[2]。本實驗對Y染色體微缺失模式及與性激素水平之間關(guān)系的進行研究，為臨床男性不育的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

2009年7月至2014年7月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院就診的男性不育患者789例，其中嚴(yán)重少精子癥患者164例，無精子癥患者194例。同時選取正常男性100例為對照組。精液分析參照第5版WHO人類精液檢查與處理手冊進行，其中連續(xù)3次精液檢查并離心檢測均未發(fā)現(xiàn)精子的男性為無精子癥患者(均為非梗阻性無精子癥患者);嚴(yán)重少精子癥患者為3次精液分析，精子濃度均＜5×106/mL。對照組為2次精液分析結(jié)果均正常的生育男性(精液量2～7 mL，精子濃度＞2×107/mL，精子總數(shù)＞4×107/mL，活動率＞60%;活動度:3級，大部分呈直線運動;正常形態(tài)精子大于50%;白細(xì)胞＜10/HP)。抽取檢測者外周血標(biāo)本進行Y染色體微缺失檢測和性激素水平的檢測。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA 提取:核酸提取采用上海萊楓生物科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)胞/血液基因組DNA 快速提取試劑盒，提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 PCR引物設(shè)計:根據(jù)NCBI 提供的STS 引物序列和參考文獻合成引物[3]，引物由Invitrogen 公司合成，引物序列見表1。

1.2.3 Y染色體微缺失檢測:以多重PCR的方法，參考?xì)W洲男科協(xié)會(European Academy of Andrology，EAA)2004版指導(dǎo)原則和歐洲分子遺傳實驗質(zhì)控網(wǎng)(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)標(biāo)準(zhǔn)，檢測的Y染色體AZF區(qū)域的15個序列標(biāo)簽位點(sequence tagged sites，STS):Ⅰ組:SY254、SY143、SY242和SY255;Ⅱ組:SY84、SY239和SY152;Ⅲ組:SY86、SY127、SY145 和SY124;Ⅳ組:SY134、SY82、SY128 和SY133;共設(shè)計15 對引物和一對內(nèi)對照引物，利用PCR 技術(shù)可從Y染色體上特異性擴增出15條非多態(tài)性短片段的序列標(biāo)簽位點(STS)和1條內(nèi)對照基因片段。這些引物對分別組合成4 套多重PCR 系統(tǒng)，在相同條件下，進行4 管PCR擴增反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判定15個STS的存在與否。

1.2.4 生殖激素水平檢測:用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及試劑盒檢測性激素水平，嚴(yán)格按照儀器要求和試劑盒說明書進行操作。男性促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)正常參考值1.4～18.1 mIU/mL，促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)正常參考值1.5～9.3 mIU/mL，睪酮(testosterone，T)正常參考值為241～827 ng/dL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進行分析。計量資料采用獨立樣本t 檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 Y染色體微缺失分布

789例男性不育患者中共發(fā)現(xiàn)40例Y染色體微缺失，占5.1%。其中無精子癥患者194例，Y染色體微缺失27例，占13.9%;嚴(yán)重少精子癥患者164例，Y染色體微缺失12例，占7.3%;1例精液濃度＞5×106/mL的Y染色體微缺失患者。Y染色體微缺失檢測(圖1)。

圖1 Y染色體微缺失檢測電泳圖Fig1 Electrophoretogram of Y chromosome microdeletion

2.2 Y染色體微缺失模式

39例Y染色體微缺失患者中(無精/少精)，共發(fā)現(xiàn)66次Y染色體微缺失(1個患者可有多個位點缺失)，其中AZFc區(qū)缺失最常見，占77.3%;SY254+SY255 為最常見缺失模式，占53.8%。Y染色體微缺失模式及分布(表2)。

2.3 Y染色體微缺失與性激素水平之間的關(guān)系

AZF區(qū)缺失不育患者組、無AZF區(qū)缺失不育患者組、正常男性對照組性激素水平進行比較，AZF區(qū)缺失不育患者組FSH 水平明顯高于其他兩組，無AZF區(qū)缺失不育患者FSH 較對照組顯著增高(P＜0.05)(表3)。

表2 Y染色體微缺失模式Table2 Models of Y chromosome microdeletion

表3 不同組患者性激素水平比較Table3 Comparation of gonadal hormone levelsin different groups (±s)

表3 不同組患者性激素水平比較Table3 Comparation of gonadal hormone levelsin different groups (±s)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with infertility patients without AZF deletion.

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3 討論

世界上目前大約有10%～15%的育齡夫婦不育，50%是由男性因素引起[4]。無精子癥或少精子癥是男性不育中最常見的因素，其中約20%的患者為非梗阻性無精子癥或少精子癥，患者大多具有正常的Y染色體形態(tài)但可能具有AZF區(qū)域的微小缺失。Y染色體在精子生成過程中發(fā)揮重要作用，Y染色體上特殊基因的缺失、突變等異常均可影響正常生精功能。AZF區(qū)微缺失在男性不育患者中的平均發(fā)生率約為8%，但存在地域差異[5]。不同研究中Y染色體微缺失的發(fā)生率差異較大，介于1%～55%[6]。這可能由于受試者納入或排除標(biāo)準(zhǔn)不一致所致，也有可能是因為選取STS 標(biāo)記位點及位置不同或?qū)嶒炇覚z查方法不一致等。

本研究中，789例男性不育患者共檢出AZF區(qū)缺失40例，缺失率為5.1%，其中358例無精與嚴(yán)重少精癥患者中AZF 總?cè)笔蕿?0.9%。以AZFc和AZFb 缺失常見，AZFa 和AZFd 缺失少見，與其他研究者的報道基本一致[7-8]。最常見微缺失模式為AZFc區(qū)SY254+SY255 缺失，占53.8%?；颊咭部杀憩F(xiàn)為多個區(qū)域的聯(lián)合缺失，如SY86+SY134 缺失。AZF 基因與精子生成密切相關(guān)，該基因位點的缺失可導(dǎo)致原發(fā)性無精或不同程度的少精，發(fā)生微缺失的區(qū)域不同，相應(yīng)的臨床表型也有所不同。

性激素也在男性生殖活動中發(fā)揮著重要作用。性激素水平受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)，任何原因引起性激素分泌軸功能紊亂，均可引起男性不育。本研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體微缺失患者和無微缺失患者的FSH 水平均顯著升高而LH 和T 則無明顯改變?？赡苁怯捎赮染色體微缺失引起曲細(xì)精管中精子生成能力下降和成熟障礙，使下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂，不能分泌足夠的抑制素去調(diào)節(jié)FSH的濃度，致使FSH濃度明顯上升，而LH 和T 無明顯影響。這與報道[9]的結(jié)果相似，但有些研究[10]卻得到相反的結(jié)果，認(rèn)為Y染色體微缺失患者的FSH值與無微缺失的患者相比明顯降低。這說明Y染色體微缺失與性激素之間的關(guān)系并不十分明確，仍需進一步研究。

Y染色體微缺失模式、性激素水平改變及染色體核型異常等因素均與男性不育密切相關(guān)，其機制十分復(fù)雜，還需進一步研究。無精子癥和嚴(yán)重少精子癥不育患者進行相關(guān)檢查對治療有重要參考價值。

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