脂多糖誘導的急性腎損傷小鼠模型腎臟中JNK信號通路的激活

覃春美，劉 琦，李 瑩，甘林望，劉 建，歐三桃

(瀘州醫學院 附屬醫院 腎病內科，四川 瀘州646000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床常見的危急重癥，其發病率逐年上升，是導致患者死亡的重要原因。由內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所導致的膿毒癥是引起AKI的常見病因[1]。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)信號通路作為促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路的重要通路之一，參與了細胞增殖與分化、細胞骨架構建、細胞凋亡和細胞惡變等多種生物學反應。既往研究發現多種腎臟疾病如梗阻性腎病、缺血性腎病、高血壓腎病及糖尿病腎病[2-5]等均存在JNK信號通路的激活。然而JNK信號通路在AKI 腎組織中的激活情況以及與AKI 等腎臟疾病關系的研究罕見報道。本研究采用LPS 誘導的AKI 小鼠模型，觀察腎臟中JNK信號通路的動態變化，進一步了解JNK 通路激活在AKI 發病過程中的重要作用和可能涉及的機制，為臨床防治膿毒血癥所致的AKI 提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性小鼠(C57B1/6J)48只，體質量25～30 g[瀘州醫學院實驗動物中心，許可證號:SYXK(川2013-065)];LPS 和α-tubulin 抗體(Sigma 公司);兔抗小鼠p-JNK 多克隆抗體和兔抗小鼠p-c-Jun單克隆抗體(San Diego 公司);生物素化羊抗兔IgG(Carlsbad公司);即用型ABC 試劑盒(武漢博士德公司);腫瘤壞死因子α ELISA 試劑盒(R＆D Systems 公司);白細胞介素1β ELISA 試劑盒(Leinco 公司)。

1.2 方法

1.2.1 AKI 模型的制備:將小鼠隨機分為對照組和AKI組，每組24只，AKI組按LPS 5 mg/kg 一次性腹腔注射給藥。正常對照組腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，腹腔注射前禁食，自由飲水。分別于給藥后1、2、4 和30 h 處死小鼠，采血及取腎組織標本(每組各6 只)。左腎部分組織固定于4%中性多聚甲醛液，經脫水、透明和包埋，制成腎組織石蠟塊，其余腎組織凍存于－80℃冰箱中備用。

1.2.2 腎功能及腎臟病理檢測:用7600 全自動生化分析儀測定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測血清胱抑素C(Cys C)水平，腎組織經常規脫水，石蠟包埋切片，行HE染色鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.3 免疫組化觀察p-JNK 和p-c-Jun蛋白表達:按照免疫組化試劑盒說明，采用ABC 法，石蠟切片脫蠟至水后，熱修復抗原，山羊血清封閉非特異性抗原，依次滴加一抗、二抗、ABC 復合物，DAB 顯色后脫水、透明、中性樹膠封片。以出現棕黃色顆粒為陽性信號。

1.2.4 Western blot檢測p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平:每一樣本稱取腎組織50 mg，用Urea RIPA 裂解緩沖液勻漿腎組織，4℃12 000 r/min 離心15 min，取上清為樣本，Bradford 方法測定蛋白濃度，每孔取40 μg 蛋白上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉移至硝酸纖維素膜上，浸入封閉液室溫孵育60 min。加抗p-JNK 抗體(或抗p-c-Jun抗體)一抗4℃冰箱過夜，加入熒光標記的羊抗兔抗體37℃孵育1 h，用ECL 探測顯影。以α-tubulin為內參照，用Image J 軟件對吸光度值進行定量分析。

1.2.5 ELISA法檢測血TNF-α 和IL-1β水平:按試劑盒說明書檢測血TNF-α 和IL-1β水平，每份標本重復3次，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 腎功能及腎臟病理檢測

與對照組相比較，AKI組小鼠于注射LPS 2 h后BUN、Scr 和Cys C 即開始明顯上升，在30 h時升高最明顯(圖1)。注射LPS后，AKI組腎組織2 h時可見腎小管輕度擴張，腎小管空泡樣變，隨著時間的延長，4 h時可見腎小管擴張更明顯，部分腎小球腫脹，腎間質可見炎性反應細胞浸潤;30 h時腎臟損傷進一步加重，偶可見部分腎小管上皮細胞凋亡、空泡樣變，甚至壞死(圖2)。

2.2 免疫組化結果

對照組腎組織中p-JNK 和p-c-Jun 在腎小球及腎小管有散在微量表達。AKI組小鼠腎組織中可見p-JNK 和p-c-Jun 在1 h時表達開始明顯增加，陽性著色較深，胞質胞核呈大量棕黃色，主要分布于腎小球足細胞、近曲小管、遠曲小管、集合管、腎血管等部位，隨時間進展表達逐漸增強，以4 h表達最強，30 h時p-JNK 和p-c-Jun表達顯著下調(圖3)。

圖1 不同時間點血清尿素氮、肌酐和胱抑素C水平Fig1 The level of BUN，Scr and Cys C at different time points(±s，n=6)

圖2 小鼠腎臟蘇木精-伊紅染色組織形態學特點Fig2 Histomorphological characteristics of kidney sections of mice(×400)

圖3 免疫組化檢測不同時間點p-c-Jun的表達Fig3 Expression of p-c-Jun at different time points detected by IHC(×200)

2.3 Western blot

注射LPS 1 h后p-JNK蛋白含量顯著升高，于4 h達峰值，以后逐漸下降，30 h時p-JNK蛋白水平明顯下降(圖4)。p-c-Jun 在LPS 作用1 h時已明顯上調，4 h達峰值后逐漸下降，30 h時與對照組無差異(圖5)。

圖4 不同時間點p-JNK的表達Fig4 Protein expression of p-JNK at different time points

圖5 不同時間點p-c-Jun的表達Fig5 Protein expression of p-c-Jun at different time points

2.4 血清TNF-α、IL-1β的檢測結果

小鼠注射LPS后1 h 血清TNF-α、IL-1β水平均較對照組升高，4 h 達峰值后逐漸下降，且30 h時仍明顯高于對照組(P＜0.01)(圖6)。

圖6 不同時間點血清TNF-α 和IL-1β的含量Fig6 The level of TNF-α and IL-1β at different time points(±s)

3 討論

AKI是危重癥患者預后的獨立危險因素，而危重患者AKI 最常見的病因為膿毒癥休克、心源性休克、創傷以及藥物中毒[6]。近來一個臨床研究報道，在ICU 病房中，50%的AKI 患者由膿毒癥所致[7]。LPS是革蘭陰性細菌外膜上的主要成分，可以啟動炎性反應，導致內毒素血癥甚至膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合征。本研究發現腹腔注射LPS 可導致小鼠迅速出現腎功能不全及腎組織病理損傷，成功誘導小鼠內毒素性AKI 模型。

JNK 又叫應激激活蛋白激酶，是MAPK信號傳導通路的重要通路之一，可被多種細胞應激如(氧化應激、炎性反應因子)等激活，被活化后可磷酸化核轉錄因子及其他蛋白激酶，調節相關基因的轉錄，進而參與細胞生長、發育和凋亡等多種病理生理過程[8]。既往研究表明，JNK信號通路激活與腎臟疾病關系密切。用H2O2刺激小鼠腎小球系膜細胞，可使p-JNK的表達上升，并使活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成增多，導致腎小球系膜細胞的損傷和凋亡[9];觀察JNK 在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠中的表達情況，結果UUO 組p-JNK的表達明顯高于對照組，認為梗阻性腎病中存在JNK信號通路的激活[2]。本研究用LPS 誘導內毒素性AKI，研究結果顯示p-JNK和p-c-Jun 在正常小鼠腎臟組織中僅有極少量表達，而在AKI 模型中，p-JNK 及p-c-Jun 在腎小球、腎小管區域的表達明顯升高，p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平在注射LPS 1 h時已顯著上調，于4 h達峰值后逐漸下降，30 h時接近正常水平。上述結果表明在AKI的極早期就存在JNK 通路的明顯激活，p-JNK及p-c-Jun 在AKI 小鼠腎臟的變化與LPS的刺激有關。本研究還發現不但小鼠AKI 模型腎組織中p-JNK 和p-c-Jun 較正常對照組明顯升高，血中TNF-α 和IL-1β水平也顯著升高，且其動態變化與JNK的變化規律呈一致性，表明膿毒癥時促炎細胞因子TNF-α 和IL-1β的升高與JNK的活化明顯相關。既往研究也證實，JNK 和c-Jun的表達可影響炎性反應的發生發展，LPS 刺激巨噬細胞分泌TNF-α 和IL-1β 等促炎反應因子與p-JNK 和p-c-Jun的激活有密切關系[10]。以上資料充分提示JNK信號通路激活可誘發TNF-α 和IL-1β 等炎性反應因子的釋放，繼而介導AKI的發生發展。

總之，C57B1/6J 小鼠腹腔注射LPS 致內毒素性AKI 模型中存在JNK 通路的激活，且參與了AKI的發生發展，提示JNK信號通路激活在LPS 誘導的小鼠AKI 發病中起重要作用。JNK信號通路有望成為內毒素介導AKI的新的治療靶點，了解其動態變化規律有利于選擇最佳時機對其阻斷和干預。

[1]Zaqer RA，Johnson AC，Lund S，et al.Acute renal failure:determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response[J].Am J Physiol Renal Physiol，2006，291:F546-556.

[2]Meng LQ，Tang JW，Wang Y，et al.Astragaloside Ⅳsynergizes with ferulic acid to inhibit renal tubulointerstitial fibrosis in rats with obstructive nephropathy[J].Br J Pharmacol，2011，162:1805-1818.

[3]Kanellis J，Ma FY，Kandane-Rathnayake R，et al.JNK signalling in human and experimental renal ischaemia/reperfusion injury [J].Nephrol Dial Transplant，2010，25:2898-2908.

[4]Hou X，Shen YH，Li C，et al.PPARalpha agonist fenofibrate protects the kidney from hypertensive injury in spontaneously hypertensive rats via inhibition of oxidative stress and MAPK activity[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，394:653-659.

[5]Ohashi N，Urushihara M，Satou R，et al.Glomerular an giotensinogen is induced in mesangial cells in diabetic rats via reactive oxygenspecies-ERK/JNK pathways [J].Hypertens Res，2010，33:1174-1181.

[6]Dellinger RP，Levy MM，Rhodes A，et al.Surviving sepsis campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock[J].Intensive Care Med，2013，39:165-228.

[7]Zarjou A，Agarwal A.Sepsis and acute kidney injury[J].J Am Soc Nephrol，2011，22:999-1006.

[8]Ma FY，Liu J，Nikolic-Patreson DJ.The role of stress activated protein kinase signaling inrenal pathophysiology[J].Braz J Med Biol Res，2009，42:29-37.

[9]Kim OS，Kim YS，Jang DS，et al.Cytoprotection against hydrogen peroxide-induced cell death in cultured mouse mesangial cells by erigeroflavanone，a novel compound from the flowers of Erigeron annuus[J].Chem Biol Interact，2009，180:414-420.

[10]Vo VA，Lee JW，Park JH，et al.N-(p-coumaryol)-tryptamine suppresses the activation of JNK/c-Jun signaling pathway in LPS-challenged RAW264.7 cells [J].Biomol Ther，2014，22:200-206.