糖尿病腎病患者蛋白尿中C3a致腎小管上皮細胞轉分化

陳忠鋒，夏楠楠，何 兵

(鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州450000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)已經成為導致終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)主要病因之一。腎小管間質纖維化是DN 進展過程中起決定作用的組織學改變，關鍵環節就是腎小管上皮細胞發生上皮-間充質細胞轉分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。研究表明補體C3 裂解產物C3a 可能是蛋白尿造成腎小管間質纖維化的因素之一。因此，本實驗應用糖尿病腎病患者蛋白尿及C3a 受體拮抗劑離體培養人腎小管上皮細胞(human renal tubular epithelial cells，hRTECs)，觀察其轉分化情況及其相關指標變化。

1 材料與方法

1.1 主要材料:選用hRTECs 為研究對象。兔抗人GAPDH 單克隆抗體、兔抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和兔抗人E 鈣黏蛋白(E-cadherin)多克隆抗體(Abcam 公司)，兔抗C3aR 多克隆抗體(Santa Cruz 公司)。C3aELISA 試劑盒(上海生工公司)。C3a 受體拮抗劑SB290157(Calbiochem 公司)。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白提取與鑒定:選取確診為糖尿病腎?、羝?0例患者的清潔中段尿液。沉淀濃縮尿蛋白，超濾滅菌。BCA法檢測蛋白濃度。進行蛋白質量驗證，排除細菌和尿液混入，－70℃保存。

1.2.2 細胞培養及分組:hRTECs 培養于含10%牛胎血清DMEM 培養基中，實驗前用無血清培養基培養12 h 進行基同步化處理，后更換為條件培養基依次分組為:1)按不同尿蛋白濃度:對照組、1.0、3.0 和8.0 mg/mL 組;2)按不同處理培養基:對照組、尿蛋白濃度8.0 mg/mL、尿蛋白濃度8.0 mg/mL+SB290157 組。

1.2.3 檢測相關指標:Western blot檢測各組E-cadherin、α-SMA、C3aR 蛋白表達情況，Image J 軟件分析目的條帶吸光度值。相差顯微鏡觀察各組細胞形態變化。按ELISA 試劑盒操作，檢測各組上清液C3a濃度。

1.3 統計學分析:應用SPSS17.0 統計軟件分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，LSD 法進行兩兩比較。

2 結果

2.1 不同濃度尿蛋白培養hRTECs，檢測表型標記蛋白及C3aR 變化(圖1)。

圖1 不同濃度尿蛋白培養hRTECs 細胞的表型標記蛋白和C3aR 變化Fig1 Changes of phenotypic marker protein and C3aR in cultured hRTECs treated with different concentrations of urinary protein

2.2 ELISA法檢測各組細胞上清液中C3a濃度(圖2)。

圖2 ELISA法檢測用不同濃度蛋白尿培養的細胞上清液中C3a濃度Fig2 Using ELISA to analyse C3a in cell culture supernatant of different concentrations proteinuria (±s，n=3)

2.3 不同處理條件培養基培養hRTECs，檢測表型標記蛋白變化(圖3)。

圖3 不同處理條件培養基hRTECs 細胞表型標記蛋白變化Fig3 Phenotype marker protein changes in different treatments media of hRTECs

3 討論

DN是導致ESRD的主要病因之一。慢性腎臟疾病進展至后期的組織學改變是腎小管間質纖維化，而其纖維化的關鍵環節就是發生EMT。

C3a具有趨化激活白細胞、介導炎性反應的作用。C3aR為C3a 受體，它不僅存在于噬中性粒細胞和單核細胞表面，也存在于腎臟細胞表面。研究認為小球濾過或小管腔內活化的補體成分是蛋白尿腎病中導致小管間質損傷主要因素之一[1]。糖尿病db/db小鼠的近曲小管和足細胞的C3aR高表達，推測糖尿病腎病可能與補體激活有關[2]。

本實驗發現，用糖尿病腎?、羝诨颊叩哪虻鞍纂x體培養hRTECs，其發生了轉分化，E-cadherin表達量下調，α-SMA、C3aR表達量上調，細胞上清液C3a 水平也升高，表明尿蛋白可致hRTECs 發生EMT，而這一過程可能與尿蛋白中C3a的水平升高，C3aR表達上調有關。這與報道[3]用C3a 刺激人腎小管上皮細胞發現C3a 參與誘導其轉分化的結論相一致。當應用了C3aR 特異性拮抗劑SB290157，發現SB290157 組hRTECs 轉分化減輕。這一結果表明在糖尿病腎病患者尿蛋白中C3a 參與導致hRTECs 轉分化，抑制C3aR 可以使其轉分化減輕。

通過研究發現補體C3a及其受體在糖尿病腎病腎小管轉分化的過程中起著十分重要的作用。因此抑制補體的激活可能成為減輕糖尿病腎病間質纖維化，延緩其進展的新治療靶點。

[1]鄭敬民，朱小東，張明超，等.高表達C3aR的肥大細胞在糖尿病腎病患者腎組織中的分布及病理意義分析[J].生物化學與生物物理進展，2011，38:262-268.

[2]Zheng JM，Zhu XD，Zhang MC，et al.Expression and possible role of C3aR in the kidney of Diabetic db/db mice[J].Prog Biochem Biophys，2010，37:847-854.

[3]Tang Z，Lu B，Hatch E，et al.C3a mediates epithelial-tomesenchymal transition in proteinuric nephropathy[J].Am Soc Nephrol，2009，20:593-603.