堿性木聚糖酶在畢赤酵母的表達及酶學性質研究*

熊科，楊玉煥，閆子祥，王曉玲，李秀婷

1(北京市質量與安全重點實驗室，北京，100048)2(北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京，100048)3(北京市風味化學重點實驗室，北京，100048)

植物纖維是自然界中最主要的可再生有機資源。在世界能源日益短缺的情況下，這些能源正越來越受到重視。植物纖維的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，其中半纖維素約占植物干重的35%，是自然界中僅次于纖維素含量的可再生資源。木聚糖是植物細胞壁中的主要結構非淀粉多糖，含量僅次于纖維素，約占細胞干重的7% ～35%［1］。

木聚糖酶(Xylanase)是一類水解木聚糖主鏈內部β-1，4木糖苷鍵的糖苷水解酶，多數作用于木聚糖的無側枝區段，產生低聚糖或帶有側枝的寡聚糖。糖苷水解酶根據催化區的保守氨基酸和疏水區的不同分為58個族［2］，大部分木聚糖酶屬于F/10或G/11族，其中 F/10族的木聚糖酶分子量大多大于30 kDa，結構多樣，除了催化區域一般還含有多種非催化區域如纖維素結合域(CBD)等，能較快地水解木聚糖生成低聚木糖和木糖。G/11族木聚糖酶結構簡單，水解木聚糖的速度慢，產物多為木寡糖［3］。不同族的木聚糖酶在結構和分子量上具有很大的區別，但是同一族的木聚糖酶則在氨基酸序列上具有較高的保守性，且催化特性相近。多數的木聚糖酶不但能催化木聚糖水解，還能水解纖維素，具有纖維素酶活，稱之為交叉活性［4］。木聚糖酶在諸多領域有廣泛的應用，微生物發酵生產木聚糖酶是目前最普遍的一種方法，但通過天然菌株發酵有一系列的弊端。隨著生物技術的不斷發展，利用工程菌株表達木聚糖酶成為解決這些弊端的有效手段。近些年畢赤酵母表達系統的發展尤為迅速，為表達木聚糖酶提供了良好的基礎，如ZHANG［5］等從瓶霉菌(Phialo-phora sp.)G5中克隆出內切-β-1，4-木聚糖酶基因 xyn10G5，并使其在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達，經過純化重組的XYN10G5的最適作用溫度和pH值分別為70℃和4.0，在pH值3.0～9.0范圍內保持穩定(＞70%的最大活性)，70℃熱穩定(保留90%的最初酶活性1 h)。

本研究對1株畢赤酵母工程菌產木聚糖酶的發酵條件進行優化，并對重組木聚糖酶的性質進行了相關的研究，旨在為木聚糖酶的工業化生產和應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養基

蛋白marker(美國Thermo);櫸木木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖、殼聚糖(美國Sigma);玉米芯水溶性木聚糖、玉米芯水不溶性木聚糖、棉子殼木聚糖、甘蔗渣木聚糖、豆稈木聚糖、麩皮木聚糖為實驗室自制。

CAPS、CHES、MES 和 MOPS，考馬斯亮藍 R-250，四甲基己二胺(TEMED)(美國Biomol);DEAE Sepharose Fast Flow(美國 GE);YNB(美國BD);Endo H酶(美國NEB)。質粒中提試劑盒，膠回收試劑盒(美國OMEGA);卡那霉素(美國 AMRESCO);LaTaq DNA(with GC buffer)，限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ、Bgl II，T4DNA連接酶(日本TAKARA);瓊脂糖(英國OXOID);BMMY培養基;BMGY培養基;MD培養基;木聚糖-剛果紅篩選平板。

其余試劑均為國產分析純。

1.2 菌種

GS115畢赤酵母宿主菌(本實驗室保存);pPIC9K畢赤酵母表達質粒(Invitrogen公司);pPIC9K-xynAeSC(實驗構建);重組畢赤酵母菌株GS115－3－20。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pPIC9K-xynAeSC的構建

根據pPIC9K載體上的限制酶位點和xynAeSC序列，選擇EcoRⅠ和Not I兩個限制酶位點。設計引物。引物序列如表1所示。

表1 含EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點的引物序列Table 1 Primers with restriction sites

分別用限制性內切酶EcoR I，Not I雙酶切表達載體pPIC9K和含EcoRⅠ、Not I酶切位點基因片段xynAeSC，37℃反應16 h。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收大小合適的片段。用DNA連接酶連接帶有粘性末端的基因片段和線性化的畢赤酵母表達載體pPIC9K(摩爾比3∶l)，16℃連接12 h，完成表達載體pPIC9K-xynAeSC的構建。重組表達載體pPIC9K-xynAeSC用Bgl II酶線性化后，用電穿孔法將其導入畢赤酵母，吸取一定體積的轉化液涂布RBD平板，30℃培養至長出菌落。參照《分子克隆實驗指南》中的方法提取重組子的基因組DNA，以此為模板進行PCR驗證。堿性木聚糖酶基因xynAeSC的常規誘導表達依據畢赤酵母多拷貝表達試劑盒(Mutil-Copy Pichia Expression Kit，Invitrogen公司)的操作手冊。

1.3.2 木聚糖酶測定的方法

木聚糖酶活力測定參照DNS法。

1.3.3 蛋白含量測定的方法

參考Lowry］的經典方法，以牛血清蛋白(BSA)作為標準蛋白繪制標準曲線。

1.3.4 聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE按照Laemmli［6］介紹的方法進行。分離膠質量濃度125 g/L，濃縮膠45 g/L，考馬斯亮蘭染色顯示蛋白帶，低分子量標準蛋白與樣品在同一條件下進行電泳。

1.3.5 重組酶(XynAeSC)純化

1.3.5.1 粗酶液的鹽析

硫酸銨50% ～80%梯度鹽析得粗酶液，8 000×g，10 min 離心，用 pH7.0，0.05 mol/L 的 Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，然后用最小100倍體積于樣品的緩沖液(pH 5.3，0.05 mol/L醋酸緩沖液)透析24 h。

1.3.5.2 DEAE Fast Flow離子交換柱層析

透析后的樣品過DEAE層析柱(1 cm×10 cm)，層析柱用pH7.0，0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液預先平衡。上樣后用相同的緩沖液洗去雜蛋白。結合到柱料上的蛋白用0～0.1 mol/L的 NaCl(溶解于pH7.0，0.05 mol/L的 Tris-HCl緩沖液)梯度洗脫，流速為1 mL/min，280 nm監測蛋白含量，流出峰用2 mL離心管收集，每管中收集1.5 mL，并分別測酶活和蛋白含量，SDS-PAGE檢測蛋白質純度。

1.3.5.3 重組酶XynAeSC去糖基化

10 μL 反應體系中加入 XynAeSC(20 μg)和1 μL 10×糖蛋白變性緩沖液，其余體積用水補足，混合均勻，沸水浴中反應10 min;然后在此反應體系中加入2 μL 10 × G5 緩沖液，1 μL Endo H 酶，添加高純水至總體系為20 μL，37℃反應1.5 h，SDS-PAGE檢測蛋白質純度。

1.3.6 酶學性質研究

1.3.6.1 最適pH值和pH值穩定性

最適pH的測定在50℃下進行，用不同的緩沖體系配濃度為0.05 mol/L，不同pH的緩沖液。分別是檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.20～4.20);醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.80～5.80);MES緩沖液(pH 5.20～7.20);MOPS緩沖液(pH 6.20～8.20);Tris-HCl緩沖液(pH 7.00～9.00);CHES緩沖液(pH 8.15～10.15);CAPS緩沖液(pH 9.30～11.30)。總的pH范圍為2.2～11.3，每種緩沖體系設5個點，共35個pH值。測定酶活時，將標準方法中的緩沖液替換為以上不同pH的緩沖液。

pH穩定性測定用上述不同pH的緩沖液稀釋酶液，使酶液處于不同的緩沖條件下，50℃下保溫30 min后立即冰浴終止反應，與不保溫的酶液作對比，計算相對酶活。

1.3.6.2 最適溫度和溫度穩定性

最適溫度的測定:將酶液用最適pH緩沖液適當稀釋，然后分別在40～95℃的不同溫度下反應10 min，測定木聚糖酶活力，以最大值為100%。

溫度穩定性的測定:將酶液在最適pH緩沖液中，50℃處理30 min后立即取樣冰水浴冷卻，與沒有處理的酶活作對比，計算相對酶活。

1.3.6.3 酶的底物特異性

以不同的木聚糖為底物(10 g/L)，測定酶活的緩沖體系為pH8.2的0.05 mol/L MOPS緩沖液，50℃反應10 min后測酶活。與樺木木聚糖為底物測得酶活值比較。天然底物包括樺木木聚糖、燕麥木聚糖、玉米芯水溶性木聚糖、櫸木木聚糖、玉米芯水不溶性木聚糖、甘蔗渣木聚糖、豆稈木聚糖、棉子殼木聚糖、麩皮木聚糖。

2 結果與討論

2.1 表達載體pPIC9K-xynAeSC的構建

按2.3.1方法，通過PCR獲得大小約為1 kbp的片段，與理論大小986 bp大小相同。經測序結果與預期相符。隨后對表達載體pPIC9K和片段xynAeSC進行酶切處理，膠回收酶切片段，隨后用T4連接酶連接分別經內切酶Eco RI和Not I處理的表達載體pPIC9K和目的基因。構建表達載體通過熱擊導入大腸桿菌感受細胞，平板涂布。待平板上長出菌落后用菌落PCR法檢測陽性克隆。

陽性克隆子擴大培養，按照提質粒方法進行驗證，結果見圖1。泳道1～5分別代表空載體pPIC9K、重組表達載體pPIC9K-xynAeSC、pPIC9K-xynAeSC經雙酶切后的片段及目的基因xynAeSC片段。泳道3、4說明目的基因已經成功克隆到重組表達載體中，實現了重組表達載體體pPIC9K-xynAeSC的構建。

圖1 重組質粒pPIC9K-xynAeSC驗證電泳圖Fig.1 The result of enzymatic digestion of pPIC9K-xynAeSC

2.2 重組蛋白的表達和鑒定

采用組氨酸的缺陷培養基方式篩選陽性克隆，得到551個陽性轉化子。剛果紅染色透明圈法初篩重組畢赤酵母轉化子，如圖2所示。

圖2 重組酶產生的透明圈Fig.2 The zone of clearance by recombinant enzyme

從551個重組菌株基因文庫中，篩選得到有透明斑現象的陽性轉化子129個，對全部陽性轉化子進行快速誘導培養，其中產酶能力達到10 U/mL以上的轉化子有15個。最終挑選產酶能力最高GS115/xynAeSC菌落3～20進行常規誘導表達8 d，并對產酶條件進行優化。然后在8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。取上清液用改良的DNS法測定木聚糖酶活性。結果表明:發酵液上清液木聚糖酶酶活可達到229±3 U/mL。

2.3 重組酶的純化

2.3.1 DEAE柱層析

DEAE層析柱(1 cm×10 cm)使用前用pH 7.0，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液預先平衡，待平衡結束后上樣，樣品先用相同的緩沖液透析。上樣后用相同的緩沖液洗去不能與柱料結合的雜蛋白。結合到柱料上的蛋白用0～0.1 mol/L的 NaCl(溶解于 pH7.0，0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液)梯度洗脫，流速為1 mL/min，280 nm監測蛋白含量，流出峰用2 mL離心管收集，每管收集1.5 mL，分別測酶活和蛋白含量，結果如圖3所示。

圖3 DEAE離子交換柱層析Fig.3 DEAE ion exchange chromatography

木聚糖酶經過DEAE離子交換層析的純化工作總結如表2所示，重組木聚糖酶的比活力提高至516.8±6.2 U/mg，回收率可達44.0% ±1.8%。

2.3.2 木聚糖酶XynAeSC去糖基化

畢赤酵母可對分泌蛋白進行O－和N－連接糖基化修飾［7］，分析木聚糖酶XynAeSC氨基酸序列發現有4個糖基化位點。Endo H是一種高效糖苷內切酶，能對重組酶去糖基化。對重組酶進行去糖基化處理后，得到了電泳純的木聚糖酶條帶，結果如圖4所示，該蛋白分子量大小為34 kDa。

表2 重組木聚糖酶初步純化結果Table 2 The result of purification of recombinant XynAeSC

圖4 XynAeSC純化過程的電泳圖和酶譜圖Fig.4 The SDS-PAGE and zymogram of recombinant XynAeSC

2.4 重組木聚糖酶酶學性質

2.4.1 最適pH值和pH值穩定性

重組木聚糖酶XynAeSC在不同pH條件下酶活如圖5所示，當反應緩沖液為pH7.2的MOPS時酶活達到最高，且酶活力穩定。當pH在6.2～8.6時，相對酶活力都在80%以上，當pH小于5.2和大于9.2時，酶活迅速下降。

隨著對木聚糖酶的認識越來越深刻，更多的木聚糖酶基因在畢赤酵母中得到了表達。張慧敏［8］等人將1株極端耐熱木聚糖酶基因Syxyn11用畢赤酵母進行重組表達，重組酶的最適pH為6.5，pH穩定范圍在5.0～7.5。目前，重組鏈霉菌屬木聚糖酶的最適 pH 多在5.0 ～6.0［9－11］，本試驗重組木聚糖酶的最適pH為7.2，且在pH6.2～8.6有較高的相對酶活，區別于其他重組酶。

圖5 重組木聚糖酶XynAeSC最適pHFig.5 The optimum pH of recombinant XynAeSC

重組酶XynAeSC在不同的pH下的相對酶活如圖6所示。50℃處理30 min后，XynAeSC在pH5.3～9.8依然能保持80%以上的相對酶活力，XynAeSC具有優良的pH穩定性，在中性偏堿性條件下的情況比較突出，能應用于酶法生產低聚木糖。

圖6 重組木聚糖酶XynAeSC pH穩定性Fig.6 The pH stability of recombinant XynAeSC

2.4.2 最適溫度和溫度穩定性

重組木聚糖酶XynAeSC在不同溫度下相對酶活如圖7所示。最適溫度為70℃，40～60℃之間木聚糖酶的相對酶活力都在70%以上，而當溫度達到75℃時殘余酶活急劇下降。Sysyn11基因在畢赤酵母中表達的外源蛋白最適溫度達到85℃，這與其來源于極端耐熱木聚糖酶有很大的關系。說明天然酶的性質與重組酶有很大相關性。Li［12］等用畢赤酵母重組表達了一個來源于黑曲霉的木聚糖酶基因，研究發現重組酶的最適溫度為50℃，溫度穩定性在40～60℃，且該酶在低聚木糖制備生產中得到了很好的應用。

重組酶XynAeSC在不同溫度下處理30 min，殘留酶活如圖8所示，當溫度小于等于60℃時，保溫30 min，殘留酶活能達到80%以上，65℃以后木聚糖酶活力急劇下降。

圖7 重組木聚糖酶XynAeSC的最適溫度Fig.7 The optimum temperature of recombinant XynAeSC

圖8 重組木聚糖酶XynAeSC溫度穩定性Fig.8 The temperature stability of recombinant XynAeSC

2.4.3 重組酶底物特異性

為了深入了解和研究重組木聚糖酶XynAeSC對底物的特異性，選擇不同的木聚糖底物，使用同樣的條件測酶活，結果如圖9所示。

圖9 重組木聚糖酶XynAeSC底物特異性Fig.9 The substrate specifity of recombinant XynAeSC

以1%樺木木聚糖為底物所測的木聚糖酶活力為100%，由試驗結果分析可知，重組酶XynAeSC以燕麥木聚糖為底物時，酶活力最高，相對酶活力為樺木的259.7%±10.7%。對甘蔗渣木聚糖的活力最低，只有樺木木聚糖的16.0% ±1.5%。且上述底物經木聚糖酶水解產物主要以木二糖為主，隨著水解時間的增加，木二糖的含量逐漸增多，經過24 h，水解以上幾種底物均沒有木糖生產。這表明，該重組木聚糖酶在生產低聚木糖的應用上具有一定的潛力。

2.4.4 CBD結構對木聚糖酶性質的比較

教酒鏈霉菌L1105產的天然木聚糖酶(44 kDa)包含催化結構域(34 kDa)和纖維素結合域(CBD，約10 kDa)兩部分。在本研究中所表達的重組木聚糖酶考慮到CBD結構有可能會影響重組酶在紙漿助漂領域中的應用，所以用畢赤酵母表達不含CBD和信號肽的酶蛋白(34 kDa)。二者的酶學性質上的差異如表3所示。

表3 單一與復合結構域的木聚糖酶性質差異Table 3 The difference in porperties between two xylanase

通過對比包含CBD與去除CBD結構的兩種酶性質發現，這兩種酶的大部分酶學性質是相近似的［13］，個別性質，如 Co2+對酶活的影響，Co2+對 34 kDa的酶蛋白有明顯的促進作用，但是卻能抑制44 kDa酶蛋白活性，這可能是由于44 kDa木聚糖酶包含有一段CBD結構使酶蛋白質構象與34 kDa的酶蛋白不同，而導致了Co2+對其活性中心影響的差異。此外，含有CBD的木聚糖酶能明顯提高對于麩皮木聚糖和豆桿木聚糖的水解作用，這與纖維素結合域能改變酶對底物的親和力有直接關系。雖然含有CBD結構能在一定程度上增加木聚糖酶對水不溶性木聚糖的水解作用，但是在某些工業領域中，如紙漿助漂中，人們希望木聚糖酶的纖維素酶活性盡量低，含有CBD結構無疑對此是不利的。

3 結論

本文主要對重組畢赤酵母產木聚糖酶XynAeSC進行了產酶條件優化，重組酶分離純化并對該重組酶的酶學性質進行了初步研究。

(1)通過DEAE離子交換層析和Endo H酶去糖基化得到電泳純XynAeSC，SDS-PAGE檢測重組蛋白分子量為34 kDa，與預測分子量大小相符。

(2)重組畢赤酵母產木聚糖酶XynAeSC的最適pH為7.2，50℃處理30 min后，XynAeSC在pH5.3～9.8之間依然能保持80%以上的相對酶活力;最適反應溫度為70℃，60℃溫度下保溫30 min，酶活力仍可保持80%。具有良好的溫度穩定性和pH穩定性。重組木聚糖酶XynAeSC對木聚糖底物表現出特異性，對燕麥木聚糖特異性最好。

(3)教酒鏈霉菌L1105產木聚糖酶中含CBD結構(44 kDa)，在水解麥麩木聚糖和豆桿木聚糖時表現出更高的水解能力。另外，Co2+對44 kDa木聚糖酶酶活有抑制作用，而對不包含CBD結構的木聚糖酶(34 kDa)酶活有促進作用。CBD結構的存在與否對木聚糖酶的基本性質無顯著影響。含與不含CBD結構的兩種酶的大部分酶學性質是相近似的。

［1］ Aspinall G O.Structural chemistry of the hemicelluloses［J］.Adv Carbohydr Chem，1959，14:429 －430.

［2］ 李鳴光，張煒銀，廖文波，等.薇甘菊研究歷史與現狀［J］.生態科學，2000，19(3):41 －45.

［3］ 江正強.海棲熱袍菌xynB基因的克隆和表達、重組木聚糖酶的提純及其酶學性質［D］.北京:中國農業大學，2001

［4］ 孫振濤，趙祥穎，劉建軍，等.微生物木聚糖酶及其應用［J］.生物技術，2007，17(2):93 －97.

［5］ Lowry O H，Rousebrough N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Biol Chem，1951，193:265 －275.

［6］ Laemmli U K.Cleavage of struetural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature(London)，1970，227:680 －685.

［7］ Duman JG，Miele RG.O-Mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins［J］.Biotechnology and Applied Biochemistry，1998，28(pt1):39 －45.

［8］ 張慧敏，李劍芳，鄔敏辰，等.耐熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質［J］.食品與生物技術學報.2013，32(2):124 －128.

［9］ 何永志，姚斌，王亞茹，等.來源于橄欖綠鏈霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表達及性質的比較分析［J］.微生物學報，2004，44(3):340 －344.

［10］ Jae-Ho Shin，Jun-Ho Choi，Oh-Seuk Lee，et al.Thermostable xylanase from Streptomyces thermo cyaneoviolaceus for optimal production of xylooligosaccharides［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2009，14:391 －399.

［11］ Thayat Sriyapai，Peechapack Somyoonsap，Kenji Matsui，et al.Cloning of a thermostable xylanase from Actinomadura sp.S14 and its expression in Escherichia coli and Pichia pastoris［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111(5):528 －536.

［12］ LI Ming-qi，WWNG Xiao-yan，SUN Jian-yi.Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan［J］.Protein Expression and Purification，2006，48(2):292 －298.

［13］ ZHAO W，ZHONG Y，YUAN H，et.al.Complete genome sequence of the rifamycin SV-producing Amycolatopsis mediterranei U32 revealed its genetic characteristics in phylogeny and metabolism［J］.Cell Res，2010，20(10):1 096－1 098.