降解豬血蛋白的優良菌株篩選鑒定及產酶條件研究*

周毅，楊萍，肖前程

1(江西師范大學高等研究院，江西 南昌，330022)2(江西師范大學生命科學學院，江西南昌，330022)

蛋白酶是一種水解酶類，主要用于食品、飼料、紡織、洗滌劑、制革、毛皮、蛋白水解物、果酒及飲料等的澄清，以及醫藥品、化妝品等的生產和生物材料的提取［1－2］。動物、植物以及微生物都可產蛋白酶。其中，微生物是蛋白酶的重要來源，這些微生物包括細菌和真菌，它們主要來自土壤、海洋和動物腸道等［3－12］。雖然運用微生物技術產蛋白酶的研究及應用取得了較大進展，但是蛋白酶高產菌種的發現仍然是研究熱點［13－14］。

豬血是一種寶貴的蛋白資源，但因血粉中蛋白質口味很差，分子質量太大難以被吸收，故目前屠宰行業中豬血的開發程度受到了很大的限制，而且周圍環境還因豬血的隨意排放而遭到了嚴重污染。而利用蛋白酶能有效降解血粉中的大分子蛋白質，大大提高其可吸收性和適口性，制成高營養的動物蛋白飼料，并從中提取食用的功能性多肽［15－19］。

近年來，雖然用于飼用和食用的蛋白酶的研究工作已有了很大的進展，但蛋白酶種類仍過于單一，尚不足以滿足需求。究其原因主要是由于獲得的菌種酶活力較低，故非常有必要篩選酶活較高的菌株來滿足國內日益增長的需求［15－16］。本研究以豬血蛋白為主要營養物質，從生豬屠宰場下水道土壤中分離產豬血蛋白降解酶的微生物，并利用豬血脅迫微生物生長的篩選方法挑選具有較高降解能力的菌種，選擇其中產酶活力最高的1株進行鑒定并對其產酶條件進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土樣

采自南昌郊區3個不同的屠宰場。

1.1.2 培養基

(1)富集培養基(g/L):豬血10，NaCl 5，瓊脂18，pH值自然。

(2)初篩酪素固體培養基(g/L):酪蛋白10，牛肉膏 3，NaCl 5，K2HPO42，瓊脂 18，pH 7.4。

(3)基礎培養基(g/L):牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂 18，pH 7.2。

(4)種子培養液(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.4。

(5)基礎發酵培養液(g/L):葡萄糖5，豬血10，KH2PO40.5，MgSO40.3，(NH4)2SO40.3，CaCl21，NaCl 1，pH 7.2。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160A型高低溫恒溫振蕩培養箱，上海一恒科技有限公司;DHP-9082型電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司;Eppendorf Centrifuge 5427R GMO 2800UV/VIS Spectrophotometer UNICO，PCR產物回收試劑盒:D6492 Omega，離心機 3K15，Sigma;電泳槽JY-SPFT，PCR 儀，Life Express，博日;電泳儀 JY300C，北京君意東方電泳設備有限公司;凝膠成像系統JY04S-3C，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富集與初篩

將從屠宰場取來的土樣，用豬血水溶液澆透并放置于25℃培養箱中數日，等土樣較為干燥，用10倍稀釋法涂布于富集培養基平板上，37℃培養3 d，挑選出生長非常旺盛的菌株于基礎培養基平板上37℃培養，觀察菌落特征，并初步分類。同時，轉接斜面培養保存備用，并將所獲菌株轉接至初篩酪素培養基平板37℃培養，分別于轉接后24 h和48 h，測量透明圈直徑和菌落直徑，計算透明圈直徑與菌落直徑比值(DC)。

1.3.2 復篩

挑取產透明圈的菌株接種于50 mL種子培養液，37℃，200 r/min，放大搖瓶培養24 h后，按照1∶100的比例將種子液轉接至基礎發酵培養液，，37℃，200 r/min搖瓶培養，每隔6 h取樣，4℃，10 000 r/min離心15 min，取上清液，測定上清液的蛋白酶活力，篩選出產蛋白酶活力最高的菌株作為出發菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

形態學鑒定:包括個體形態、菌落形態;利用革蘭氏染色法及芽孢染色法對菌體進行染色并于顯微鏡下進行觀察和拍照。

生理生化學鑒定:包括糖發酵試驗、明膠液化試驗等參考《伯杰細菌鑒定手冊》［20］的部分經典實驗方法。

分子生物學鑒定:以細菌16S rRNA基因的通用引 物 (F:5 ＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ＇，R:5 ＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇)對擬鑒定菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增(引物由北京信諾金達生物科技有限公司合成)。PCR反應體系為:2×PCR REACTION MIX 25μL，引物(25 pmol/μL)各 1 μL，目標菌液 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 20 μL，總體積 50 μL。PCR 反應條件:94 ℃4 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35個循環;72℃ 10 min。將PCR產物進行測序，菌株序列由北京信諾金達生物科技有限公司測定。測序結果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)網站的核酸數據庫對比系統(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上進行 Blast比對［21］，并選擇同源性較高的序列用Neighbor-Joining法［22］構建系統發育樹。

1.3.4 產酶條件的探索

1.3.4.1 種子培養

250 mL的三角瓶裝入50 mL的種子培養基，從平板接入1環菌，旋轉式搖床200 r/min搖瓶培養，37℃培養16～18 h。

1.3.4.2 菌株最佳產酶時間的確定

于250 mL的三角瓶裝入50 mL的基礎發酵培養基，按照1%的接種量接入培養16～18 h的菌株B12種子液，旋轉式搖床200 r/min搖瓶發酵，37℃培養，每隔6 h取樣測定酶活力，得到菌種產酶活力曲線。

1.3.4.3 菌株最佳產酶溫度的確定

于250 mL的三角瓶裝入50 mL的基礎發酵培養基，以1%的接種量接入培養16～18 h的菌株B12種子液，分別在25，30，35，37，40，45 ℃，200 r/min 下振蕩培養24 h后測定產酶情況，確定菌種產酶溫度。

1.3.4.4 培養基初始pH值對菌株B12產酶能力的影響

于250 mL的三角瓶中分別裝入50 mL pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的發酵培養基，以 1% 的接種量接入培養16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發酵，33℃培養。

1.3.4.5 不同碳源對菌株產蛋白酶的影響

分別配制含有0.5%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、0.5%蔗糖、0.5%甘油、0.5%的乳糖為唯一碳源的發酵培養基，并分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶含50 mL發酵培養基，以1%的接種量接入培養16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發酵，33℃培養24 h，測定產酶情況。

1.3.4.6 不同氮源對菌株產蛋白酶的影響

為了解不同氮源對B12菌株產蛋白酶的影響，分別配制含有 0.5%豬血、KNO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、牛肉膏、及酪素為唯一氮源的發酵培養基，并分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶含50 mL發酵培養基，按照1%的接種量接入培養16～18 h的菌株B12種子液，200 r/min搖瓶發酵，33℃培養24 h，測定產酶情況。

1.3.5 粗酶液的制備

取發酵液，在10 000 r/min下冷凍離心20 min，上清液即為蛋白酶粗酶液。

1.3.6 蛋白酶活力測定

取粗酶液適當稀釋，取4支試管編號(1號為空白對照)，分別加入酶液1 mL，1號管立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，使酶失活，另3支樣品加入1 mL pH 7.0、濃度為2%的酪蛋白底物緩沖液，迅速混勻，并立即放入40℃恒溫水浴，準確計時，保溫10 min后，立即加入0.4 mol/L TCA溶液2 mL，終止反應，同時向1號空白管中加入1 mL 2%酪蛋白底物緩沖液，搖勻，取出離心或過濾除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各試管濾液1 mL，分別移入另4支試管中，再加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5 mL和已稀釋的福林-酚試劑1 mL，搖勻，保溫顯色20 min后，進行比色測定(波長660 nm)。對照標準曲線，計算酪氨酸含量。

蛋白酶活力定義:1 g固體酶粉(或l mL酶液)，在40℃，pH 7.0，l min內水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。

2 結果

2.1 產蛋白酶菌株的篩選

選擇在富集培養基上生長旺盛的菌株點種在酪素培養基上培養，可以產生水解透明圈的說明其產蛋白酶，水解透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)的比值(D/d)越大說明產酶能力越強。菌株的初篩結果共獲得可產透明圈的有20株，其中有10株產透明圈較大的菌株，如表1所示。分別命名為B22，B12，B41，B11，B21，B13，B42，B43，B31，B32。其中 B22 所產透明圈直徑和菌落直徑比值最大。

表1 產蛋白酶菌株初篩結果(±s，n=3)Table 1 Results of primary screening of 10 protease-producing strains

表1 產蛋白酶菌株初篩結果(±s，n=3)Table 1 Results of primary screening of 10 protease-producing strains

菌落編號 透明圈直徑(D)/mm細菌直徑(d)/mm DC B22 25±0.2 3±0.2 8.3 B12 22±0.2 3±0.2 7.3 B41 19±0.1 3±0.0 6.3 B11 31±0.4 6±0.2 5.2 B21 31±0.4 4±0.1 7.8 B13 20±0.2 3±0.1 6.7 B42 12±0.3 2±0.0 6.0 B43 17±0.4 2.5±0.0 6.8 B31 16±0.3 3±0.0 5.3 B32 12±0.2 2±0.0 6.0

將初篩得到的10株菌株分別接種到液體發酵培養基中，進行搖瓶培養每隔6 h測定各發酵液的蛋白酶活力，將最高處酶活記錄比較，結果如表2所示，其中B12菌株產的蛋白酶活力最高，綜合水解透明圈和酶活力2個指標，選擇菌株B12為出發菌株，進行后續實驗。

2.2 產蛋白酶菌株B12的鑒定

菌株B12的形態學與部分生理生化鑒定

形態特征:在基礎培養基平板上于37℃培養24 h后，產生白色，不透明，表面粗糙，扁平不規則的菌落。挑取新鮮的菌落，進行涂片、固定和革蘭染色，結果顯示該菌為革蘭陽性細菌(圖1)。鏡檢觀察為短直桿狀，大小1.0～1.2×3.0～5.0 μm，產芽孢，芽孢呈柱狀，芽孢中生或近中生(圖2)。

表2 產蛋白酶菌株的復篩Table 2 Results of re-screening of protease-producing strains

圖1 菌株B1革蘭氏染色結果Fig.1 The result of B12 Gram staining

圖2 菌株B12芽孢染色結果Fig.2 The result of B12 spore staining

生化特征:革蘭氏染色呈陽性;V.P試驗陽性;M.R試驗陽性;吲哚實驗陰性;葡萄糖發酵陽性;能分解酪素;淀粉水解為陽性;可液化明膠作用于硝酸鹽。根據各項指標的檢測結果，依照伯杰細菌鑒定手冊［20］，初步認為篩選到菌株B12為芽孢桿菌屬。

菌株B12的分子學鑒定:以菌株B12的總DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增，檢驗得到1條934 bp的條帶。切膠測序得到16S rDNA序列。將序列在NCBI(National Center for Biotechnol-ogy Information)網站的核酸數據庫對比系統(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)利用 BLAST進行同源性比較，結果顯示同源性較高的菌株為Bacillus cereus.，同源性為99%。采用MEGA軟件進行系統發育樹分析，結果(見圖3)發現其與2株蠟樣芽孢桿菌聚在一起，且相似度為99%。結合上述的細胞形態學觀察及生理生化試驗的結果，初步將該菌株歸屬于蠟樣芽孢桿菌，暫定名為Bacillus cereus.B12。

圖3 基于B12和相關菌株的16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequencesof B12 and related strains

2.3 產酶條件的探索

2.3.1 菌株最佳產酶時間的確定

不同時間的產酶量如圖4所示，在發酵12 h內，基本不產蛋白酶;發酵12 h之后蛋白酶活力迅速提高;發酵 24 h時，蛋白酶活力達最大，為 172.48 U/mL。隨著發酵時間的延長，酶活力穩定在一定數值。因此，選擇24 h為發酵周期。

圖4 發酵時間對產酶的影響Fig.4 Effection of Fermentation time on the protease production

2.3.2 菌株最佳產酶溫度的確定

不同溫度條件下菌株B12的產酶能力如圖5所示。由圖5可見，溫度低于30℃時酶活增長緩慢，當溫度升到30℃之上酶活力較高，溫度為33℃時酶活最高。但溫度升高到40℃以上酶活迅速降低。因菌株B12屬于蠟樣芽孢桿菌，最適的生長溫度在30～37℃，超過40℃一般不生長，由此可以看出酶活與菌株的種屬有一定的關系。

圖5 溫度對產酶的影響Fig.5 Effection of temperature on the portease production

2.3.3 培養基初始pH值對菌株B12產酶能力的影響

不同初始pH值對菌株B12產酶的影響結果如圖6所示。由圖6可以看出，pH值對菌株產酶的影響較大，產酶的最佳pH值為7.0，酶活可以達172.48 U/mL，在pH值為6以下時細菌幾乎不產酶，而pH值高于8時，酶活亦很低。菌株在初始pH值為5.5～7時，酶活隨pH值的增大而增大。在pH值為7時酶活最高，當pH值高于7時酶活隨著pH值的增大而減小，當pH值達到8.5時，不適應菌株的生長，所以酶活幾乎為零。故產酶的最佳pH值為7。

圖6 初始pH對產酶的影響Fig.6 Effection of initial pH value on the protease production

2.3.4 不同碳源對菌株產蛋白酶的影響

不同碳源種類對菌株B12產酶能力的影響如圖7所示。由圖7可見添加蔗糖、甘油、可溶性淀粉、葡萄糖作為唯一碳源時都有利于菌株B12產蛋白酶，其中葡萄糖作為唯一碳源時最有利于菌株B12產蛋白酶。

2.3.5 不同氮源對菌株產蛋白酶的影響

氮源種類對菌株B12產酶能力的影響如圖8所示。由圖8 可見，添加酪素、(NH4)2SO4、KNO3、牛肉膏、蛋白胨、豬血、酵母粉作為氮源時都有利于菌株B12產蛋白酶，其中豬血作為唯一氮源時菌株B12產蛋白酶可達185 U/mL。

圖7 碳源對產酶的影響Fig.7 Effection of carbon source on the protease production

圖8 氮源對產酶的影響Fig.8 Effection of nitrogen source on the protease production

3 討論

本試驗以豬血為單一碳源及氮源，以脅迫生長的方式，從屠宰場附近的土壤中篩選得到10株產蛋白酶的菌株，經過復篩酶活力，得到1株產酶能力較高的菌株B12。根據形態鑒定，生理生化特性比較和16S rRNA基因序列分析，該菌株歸屬于蠟樣芽孢桿菌，暫定名為Bacillus cereus B12，GenBank中的序列登錄號為ZSHXNEZP015。

從發酵產蛋白酶的情況來看，該菌株在溫度為33℃時產酶能力最強，初始pH值為7.0時產酶活力最高，該菌在30～37℃及pH 6.5～7.5范圍內相對酶活都比較高，說明此菌株所產蛋白酶具有較好的產酶穩定性。通過對碳源分析發現葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘油均可作為菌株B12較好的碳源，且葡萄糖對于菌株高效產蛋白酶有利。對氮源分析可以發現豬血、KNO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、牛肉膏、及酪素均可作為菌株B12較好的氮源，而以豬血為唯一氮源時產酶活力可達185.48U/mL，說明此菌株產生的蛋白酶能很好地降解豬血蛋白。

已報道的產蛋白酶種屬有二十多種，由于酶活定義的不同，尚不能對篩選到的所有菌株的蛋白酶活性進行比較，但從已公布的報道來看，本試驗篩選的產蛋白酶菌株B12不僅具有較高的產蛋白酶活的能力，還能夠較好地降解豬血蛋白，此菌株若經隨后的誘變育種或是基因工程等手段進行改造有望進一步提高菌株的產酶能力，有可能為豬血蛋白的高效利用提供技術支持。

此菌株經初步鑒定屬于蠟樣芽孢桿菌，是否會產毒素還有待于進一步研究，若此菌株會產毒性，則還需進一步尋求相關方法(如基因工程的方法)消除此菌害處，才能使之用于降解豬血獲得相關蛋白質產品的生產當中。

［1］ 薛林貴.我國堿性蛋白酶的應用及研究進展［J］.微生物學通報，1997，24(6):370 －371.

［2］ 閆志勇，畢春霞，辛曉妮，等.1株高產蛋白酶嗜麥芽寡養單胞菌的分離鑒定及其酶學活性的研究［J］.微生物學雜志，2010，30(5):7 －11.

［3］ Gupta R，Beg Q K，Lorenz P.Bacterial alkaline proteases:mloecular approaches and industrial application［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2002，59:15 －32.

［4］ 熊澤，邵偉，黎姝華.獼猴桃醋的研制及營養分析［J］.食品工業，2000(5):20－21.

［5］ 劉海軍，樂超銀，邵偉，等.一株高產蛋白酶芽孢桿菌的鑒定［J］.中國釀造，2009，28(9):18 －20.

［6］ 張晶，王戰勇，韓玉，等.堿性蛋白酶產生菌株的篩選及鑒定［J］.化學與生物工程，2006，23(10):42 －43.

［7］ 李世貴，陳明杰.草菇蛋白酶的分離、純化及等電點的測定［J］.菌物系統，2003，22(2):335 －338.

［8］ 李林坷，高玉千，崔錦，等.一株蛋白酶產生菌的篩選及酶學性質研究［J］.河南農業科學，2006(3):50－52.

［9］ 于宏偉，栗志丹，郝珊珊，等.蛋白酶產生菌的篩選及酶學性質研究［J］.農產品加工·學刊，2006(10):67－70.

［10］ 黃志強，林白雪，謝聯輝.產堿性蛋白酶海洋細菌的篩選與鑒定［J］.福建農林大學學報:自然科學版，2006，35(4):416－420.

［11］ 馮新忠，王詠星，范鎮明，等.額爾齊斯河野生丁腸道產蛋白酶菌株的初步鑒定及產酶條件的研究［J］.食品工業科技，2008，29(4):104 －106.

［12］ 賀中華，陳昌福，高宇，等.黃鱔腸道益生菌HY-136的鑒定與系統發育分析［J］.華中農業大學學報，2009，28(6):715－718.

［13］ 謝承佳.微生物高溫蛋白酶的研究和應用進展［J］.安徽農業科學，2010，38(30):16 765 －16 766.

［14］ 趙祥杰，楊榮玲，孔軍，等.一株高效降解蠶蛹蛋白的菌株篩選與初步鑒定［J］.蠶業科學，2013，39(1):139－145.

［15］ 張濱，馬美湖，唐道邦，等.畜禽血的微生物降解技術和綜合利用［J］.肉類研究，2003(2):44－48.

［16］ 黃群，馬美湖，楊撫林，等.畜禽血的開發利用［J］.肉類研究，2003(3):37－40.

［17］ Saiga A，Tanabe S，Nishimura T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment［J］.J Agric Food Chem，2003，51(12):3 661－3 667.

［18］ 許慶陵，曾慶祝，朱莉娜，等.鰱酶解物對羥自由基的清除作用［J］.水產學報，2004，28(1):93 －99.

［19］ Senji S，Yumi T，Noriyuki I，et al.Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysate in a linoleic acid oxidation system［J］.Food Chemistry，2004，86(1):99 －103.

［20］ 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8版.北京:科學出版社，1984:730－731.

［21］ Altschul S F，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.Journal of Molecular Biology，1990，215(3):403－410.

［22］ Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL-X windows interface:Flexible strategies for multiple sequencealignment aided by quality analysis tools［J］.Nucleic Acids Research，1997，25:4 876 －4 882.