溶菌酶及其在食品工業中的應用*

范林林，林楠，馮敘橋，王晶晶，楊文晶，許泰百

1(渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)2(沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽，110866)3(遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧錦州，121001)

溶菌酶(lysozyme，EC 3.2.1.17)是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，因其具有溶菌(細菌、真菌)作用，故命名為溶菌酶。溶菌酶能夠破壞微生物細胞壁的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，分解不溶性黏多糖為可溶性糖肽，所以又稱胞壁質酶或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶［1］。除此之外，還可與帶負電荷的病毒蛋白結合，與脫輔基蛋白、DNA、RNA合成復鹽，使病毒失活。溶菌酶來源較為廣泛，除可從動物、植物及微生物中獲得，已有較多基因工程重組溶菌酶(DNA重組)的報道。根據來源不同，可將其分為植物溶菌酶、動物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌體溶菌酶，其中動物溶菌酶又可分為C型(雞蛋清溶菌酶)、G型(鵝蛋清溶菌酶)和I型(無脊椎動物溶菌酶)［2］。

1992年FAO/WTO的食品添加劑協會公布:溶菌酶應用于食品工業中是安全的，我國衛生部2010年第23號公告批準溶菌酶等物質為食品添加劑。在食品中，溶菌酶可選擇性地使目標微生物細胞壁溶解，致使內容物流出，從而使其失去生理活性，可以安全替代對人體健康有害的化學防腐劑，是一種無毒副作用的天然保鮮劑、安全綠色的添加劑［3］。其中，在食品工業中主要應用于水產品、乳制品、果蔬、肉類、酒及飲料的防腐保鮮，不同來源的溶菌酶的最適作用條件各不相同，因此了解溶菌酶酶學性質對減少其在食品工業應用中的損失具有較大意義。本文綜述了溶菌酶的酶學性質及其在食品工業各個領域中的應用，以期為溶菌酶在食品工業中的應用提供重要的基礎參考。

1 溶菌酶的分離純化與改性

1.1 溶菌酶的分離純化方法

為了達到良好的分離效果，必須根據來源的不同，選擇適宜的分離方法。同時，單一的分離純化方法一般無法滿足回收率和純度的要求，應將兩種或者幾種方法聯合使用，按照一定的順序進行分離，或者建立連續式的分離體系。由于溶菌酶來源眾多，其分離純化也有超濾法、親和色譜法、離子交換法和直接結晶法等多種方法(表1)。隨著新的生物分離技術的出現，反膠團萃取、染料親和色譜、雙水相萃取、親和膜色譜、親和沉淀等分離純化方法也被采用［4］。結晶法是普遍采用的方法，其中膜結晶受到越來越多的關注，膜結晶具有結晶誘導時間短、結晶過程可控、蛋白質初始濃度低等優點。

雞蛋清中溶菌酶的含量較高，因此目前國內外主要從中提取溶菌酶。傅冰等人采用二次硫酸銨沉淀和離子交換層析透過法分離溶菌酶，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測其純度，研究雞蛋清中溶菌酶的分離提取工藝，酶活提高超過15倍，回收率為15.76%，是目前一種高效的提取方法［5］。

1.2 溶菌酶作為天然生物防腐劑的改性研究

天然溶菌酶主要作用于革蘭氏陽性細菌，而對革蘭氏陰性菌效果不明顯，原因是革蘭氏陰性菌細胞壁中肽聚糖含量很少，并被脂多糖類物質包裹［6］。為了實現溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抑制作用，需對天然溶菌酶進行改性。

表1 溶菌酶的分離純化方法Table 1 Methods of separation and purification of lysozyme

溶菌酶的改性常通過化學修飾或熱改性的方法來探索和實現，如果所使用的化學修飾劑是非食品級的，則存在安全隱患;熱改性后的溶菌酶可能存在對革蘭氏陽性菌的作用降低的問題［12］。因此研究學者常采用超高壓處理，通過不同的溫度、壓力、施壓方式和保壓時間改變天然溶菌酶的結構，由表2可知，超高壓能拓寬溶菌酶的抗菌譜，避免了化學修飾和熱改性的缺點［8］。溶菌酶經生物改性后，其抑菌活性增強，擴大了溶菌酶的作用范圍(表2)。

表2 天然生物防腐劑溶菌酶的改性研究［6］Table 2 Research progress on modification of lysozyme as natural biological preservative［6］

2 溶菌酶在食品工業中的應用

在食品工業中，溶菌酶作為一種無毒、無副作用、安全性高的天然蛋白質，能選擇性地使目標微生物細胞壁溶解而使其失去生理活性，并且對食品中的其他營養成分影響很小，因此成為食品防腐劑和營養保健品的優選對象。溶菌酶的殺菌屬于冷殺菌，可避免高溫殺菌對食品營養和風味的破壞作用，尤其對熱敏感的食品更具有重要意義。

2.1 用于水產類制品的保鮮和防腐

因溶菌酶具有殺菌、抑菌的作用，近年來，很多研究學者研究了溶菌酶對水產品的防腐保鮮效果，并且取得了良好的成果。表3列舉了溶菌酶在不同水產品中防腐保鮮的應用實例，除此之外，溶菌酶還可作為魚丸等水產熟制品的保鮮劑，將一定濃度的溶菌酶溶液噴灑在產品上，可起到防腐保鮮的作用;一些新鮮水產品(蝦、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌溶液中浸漬5min后，瀝去水分，進行低溫貯藏，均可延長貯存期［7］。

表3 溶菌酶在水產品中的若干應用實例Table 3 Several application examples of in fresh-keeping of aquatics

2.2 在乳制品中的應用

溶菌酶是一種非特異性免疫因子，人乳中溶菌酶的含量約是牛乳中的3 000倍，將溶菌酶添加到乳粉中，使牛乳人乳化。據報道，溶菌酶對腸道中腐敗性微生物有殺滅作用，能促進嬰兒腸道內雙歧桿菌的增殖，促進人工喂養嬰兒腸道菌群的正?；€能增強機體對感染的抵抗力，對早產嬰兒有預防消化器官疾病、體重減輕的作用，是配方奶粉及嬰兒食品等的良好食品添加劑。

向乳制品特別是巴氏殺菌奶中添加溶菌酶，能有效延長其保存期，一般在包裝前加入300～600 μg/mL;另外，由于溶菌酶具有一定的耐高溫性，因而也可被用于高溫瞬間殺菌奶中。郭慶啟等［13］人報道了溶菌酶經固定化后耐熱性提高、耐酸性增強;固定化后的溶菌酶與底物殼聚糖的親和力下降，重復使用5次時，酶活力殘留率為57.6%。在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的起泡、風味變差，并且對奶酪老化過程中奶酪基液的品質不造成影響，同時還能起到較好的抑菌作用，不至引起酪酸發酵，有效防止由于丁酸梭狀芽孢桿菌(Clostridium tyrobutyricum)污染發酵奶酪中的乳酸鹽而產氣或“后期的開裂”現象。此外，還能利用溶菌酶生產酵母浸膏和核酸類調味品。溶菌酶還可作為防腐劑用于蛋糕、奶油等極易腐敗變質的食品中。據報道轉基因羊能夠產生富含溶菌酶的奶，溶菌酶含量可達到270mg/L，占人乳的67%。

2.3 在肉制品中的應用

溶菌酶與EDTA聯合應用在火腿、臘腸及其他肉制品等中，已取得了較好的協同保鮮效果。溶菌酶對于控制冷鮮肉的細菌總數的增殖、減緩TVB-N值的上升方面也具有明顯效果，GNa液、Nisin、溶菌酶三者配合處理冷鮮肉，取得了非常理想的保鮮效果［14］;張杰等［15］人研究表明，0.75 g/L乳酸鏈球菌肽、1.0 g/L溶菌酶及2.0 g/L殼聚糖保鮮劑結合真空包裝對兔肉的保鮮效果較好，可使其在0～4℃冷藏條件下保鮮期達至27 d。Huang等［16］人研究了溶菌酶、殼聚糖及有機累托石復合涂膜對豬肉保鮮效果的影響，結果表明，能夠有效抑制大腸桿菌和黃色葡萄球菌的生長繁殖，保存豬肉至21 d左右。

2.4 在果蔬產品中的應用

近年來，溶菌酶也廣泛應用于果蔬的防腐保鮮中，并且起到了良好的保鮮效果。表4列舉了近幾年溶菌酶及溶菌酶與其他物質配伍應用于果蔬保鮮中的若干實例。除此之外，溶菌酶對豆豉和四川泡菜等熱敏感的發酵食品具有防腐抑菌作用，可有效地抑制發酵食品發生褐變，維持原有色澤，還可極明顯地減少食鹽用量，降低泡菜和豆瓣的咸味，提高產品風味，同時避免了高溫殺菌對這類食品風味的破壞作用。此外，Kerkaert等［17］人使用溶菌酶作為一種蛋白質的指示劑，來檢測鮮切蔬菜中過敏蛋白質的行為。

表4 溶菌酶在果蔬貯藏中的若干應用實例Table 4 Several application examples of in fresh-keeping of fruit and vegetables

2.5 在保健功能性食品中的應用

溶菌酶具有一定的保健作用，有抗感染和增強抗生素作用效力，促進血液凝固及止血，促進組織再生和瘢痕形成等作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。研究報道了在飼養肉雞中用溶菌酶代替氧氟沙星、磺胺類、氟苯尼考等化學保健品，結果表明，溶菌酶組出欄用藥成本、雞群總重和死亡率等均顯示較好效果。此外，醫學上，若在牙膏、漱口水、口腔清潔劑、口香糖中設法添加一定量的溶菌酶，可以殺死導致蛀牙的病菌，達到預防蟲牙的目的。

2.6 在食品包裝材料中的應用

目前有關溶菌酶在包裝材料上應用的理論研究較多，即將溶菌酶固定在食品包裝材料上，生產出有抗菌功效的食品包裝材料，延長食品貨架期。目前許多肉制品軟包裝都要進行高溫滅菌處理，經此處理后的肉制品脆性變差甚至產生蒸煮味，影響消費量;如果在肉制品真空包裝前添加一定量的溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏殺菌(80～100 ℃，25～30 min)，可獲得很好的保鮮效果，避免了高溫滅菌帶來的負面影響。同樣，果蔬加工前添加一定量的溶菌酶，一般添加量為0.1% ～0.2%(拌料時添加)或1% ～3%(加熱煮制時添加)，也能起到很好的保鮮效果。Gemili等［23］人研究了溶菌酶固定在醋酸纖維酯包裝材料上，能夠有效維持溶菌酶的活性，提高溶菌酶的抗菌活性。Corradini等［24］人報道了溶菌酶結合溶膠技術制成抗菌膜，研究了其抗菌活性，結果表明了該處理能夠有效地抑制微生物的生長繁殖。杜會云等［25］人證實了添加殼聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分離蛋白膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母和黑曲霉等微生物均有顯著的抑制作用。用蛋清溶菌酶配制的2%～3%酶液，噴灑于包裝紙上或浸入酶液(2～3 h)，烘干，包裝煮熟的大豆、饅頭，貯藏1周不變味，而用普通紙包裝的這些食品貯藏1 d就會發黏變味。

2.7 溶菌酶的其他作用

溶菌酶是低度酒的理想防腐劑，可防止低度酒中酸菌的繁殖生長，不影響酒的風味，溶菌酶已應用于純生啤酒中［26］;溶菌酶還可應用于飲料(pH 6.0～7.5)的防腐，果汁和料酒中也有應用。在生面條、花生醬和色拉等食品中加入溶菌酶，也可起到良好的保鮮效果。溶菌酶在家禽飼料中使用，可降低發病率，能提高血清中溶菌酶含量和免疫功能。溶菌酶固定在空氣過濾器上，可作為空調的空氣凈化系統，使其具有高效除塵、殺菌兩大功能。溶菌酶在化妝品中也應用。

利用溶菌酶處理革蘭比陽性細菌還可得到原生質體，因此，溶菌酶也是基因工程、細胞工程中細胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶與免疫球蛋白的功能緊密聯系，可進入機體增強抗體活性，從而殺滅有害微生物，溶菌酶對引起仔豬腹瀉的埃希氏大腸桿菌和輪狀病毒都具有較強的抑制作用。用溶菌酶非專一性地降解海洋生物高分子殼聚糖，使其成為能被人體吸收的、低分子質量的、有獨特的生理活性和功能性質的低聚殼聚糖。因此，開發溶菌酶具有良好的經濟價值。

3 溶菌酶與其他技術結合的應用研究

隨著食品工業的快速發展，各種高效、安全的食品保鮮技術層出不窮。將溶菌酶與其他保鮮技術結合，能夠使食品在加工和貯藏時取得良好的防腐保鮮效果。

3.1 溶菌酶與輻照保鮮技術

食品輻照保鮮已被證明是一種高效、安全的加工手段。水產品腐敗菌中大部分是革蘭氏陰性菌，該菌對射線較為敏感，國外關于冰鮮魚的輻照保鮮研究得出，輻照劑量為1kGy即可起到很好的保鮮作用［27］。較低溫度時輻照出口冷凍蝦仁，可降低輻照劑量，且保鮮效果較好。因此，將溶菌酶、輻照及與低溫協同保鮮可以進行嘗試研究，且輻照對溶菌酶抑菌活性是否有促進或是抑制作用可成為研究重點。

3.2 溶菌酶與高壓超聲波處理技術

Gomez等［28］研究發現，在 300 MPa 的水壓下，冷凍煙熏鲯鰍肉片的感官品質是最佳的，且減少貯藏前期微生物的含量。據Nakimbugwe［29］等報道:在相同的超高壓處理下，溶菌酶為食品防腐提供了另一個屏障。食品經過超高壓超聲波(manosonication，MS)雙道處理，可提高枯草芽孢桿菌的芽孢對溶菌酶的敏感性，并且推斷超聲波處理可以破壞芽孢外層，降低其耐熱性。

3.3 溶菌酶與氣調包裝技術

氣調包裝(MAP)技術是目前流行的一種無防腐劑或低防腐劑量的包裝技術。Fernandez等［12］將溶菌酶與氣調包裝結合，能使大西洋鮭魚片的貨架期延長，其保鮮效果優于單一的溶菌酶處理組。謝晶等［30］人將復合生物保鮮劑(1.0%殼聚糖+0.4%茶多酚)結合氣調包裝，處理帶魚，既延長了貨架期，又能較好維持感官品質，取得了良好的保鮮效果。溶菌酶結合高壓CO2可使酸土脂環酸桿菌芽孢核心物質2，6-吡啶二羧酸(DPA)發生大量泄露，且部分芽孢完全破裂，因此溶菌酶與高壓CO2殺滅芽孢的協同效果較好［31］。

4 溶菌酶應用中所存在的問題

目前我國提取的溶菌酶的純度和活性遠不如國外的，溶菌酶提取技術需要深入研究。溶菌酶的高端產品主要被美國、加拿大等國公司壟斷，我國只能作為粗品原料出口，而且高端產品還要依賴進口，這些事實嚴重阻礙了我國溶菌酶產業的發展。一些學者通過物理、化學或生物的方法對溶菌酶進行改性研究，以期獲得對G－菌較好的抑制或滅菌效果。溶菌酶經化學改性后，酶的空間構象會發生變化，但是尚不能準確解釋其結構和功能的關系此外，如果所使用的化學修飾劑屬非食品級，則化學修飾后的溶菌酶在食品領域使用的安全性，有待進一步研究證明。

另外，溶菌酶作為酶類生物保鮮劑，需在適宜的溫度、pH、水分等條件下，才能發揮較大的活性。而一些水產品及肉產品生產過程中一般會有高溫殺菌工序;且一般進行低溫保藏，這兩種操作極有可能使得溶菌酶的抑菌效果較差。熱變性的溶菌酶，雖然喪失了酶活，但仍可對多種細菌和真菌表現出抗菌活性，例如T4溶菌酶，溶菌酶的抑菌活性與酶活之間的關系有待考究。此外，溶菌酶具有專一性，單一使用溶菌酶對酵母、霉菌引起的腐敗變質不能起到很好的保鮮作用，應使用復合生物保鮮劑。溶菌酶對動物腸道菌群的影響缺乏具體的研究報道，影響了其作為營養功能食品添加劑的推廣應用。不同來源的溶菌酶對產品的保鮮效果是否具有協同作用等也需進一步考究。

5 展望

隨著產品市場競爭的日趨激烈，發展綠色、安全、優質、高效的產品將是食品工業發展的必然趨勢，其中溶菌酶滿足了這一需求，目前，有關溶菌酶的研究熱點是除了殺菌功能以外的其他未知生物學作用，其次是有關人溶菌酶的應用研究。人溶菌酶通常是從人乳或胎盤中少量提取，然而來源困難，提取方法復雜，因此不能進行大規模工業化生產，采用基因工程技術，從細菌或酵母中生產人溶菌酶是解決其供需矛盾的主要途徑。人溶菌酶參與機體的防御機制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調節的作用，具有潛在的臨床應用價值，前景是可觀的。通過基因工程途徑生產溶菌酶可較大程度地降低成本，以推動其在醫藥業、食品工業、畜牧業等領域中的應用。

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