華根霉細胞總蛋白及膜蛋白雙向電泳優化體系的建立*

郭月，王棟 ，徐巖

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，食品安全與營養協同創新中心，江南大學生物工程學院釀造微生物及應用酶學研究室，江蘇無錫，214122)

絲狀真菌作為重要的工業微生物，在傳統發酵食品和現代發酵工業中都有廣泛的應用［1－4］。但是，由于絲狀真菌生理及其代謝的復雜性，目前對其相關代謝和調控機制的認識尚不充分，難以進行有效的工業生產控制［5－6］。隨著系統生物學研究技術的進步，通過蛋白質組學在分子水平研究絲狀真菌的內在代謝和調控機制成為可能。它能直觀反映出蛋白質表達量的變化，可獲得大量與真菌代謝調控及應激表達相關的蛋白信息，已在絲狀真菌研究中得到了應用［7－11］，為深入研究真菌的代謝調控機制提供理論根據。雙向電泳技術(2-DE)因其高通量、高分辨率、快速、簡單等優點成為蛋白質組學研究的核心手段。通過優化樣品制備和操作條件，獲得高質量、可重復的2-DE圖譜，是進行蛋白質組學研究的基礎。由于蛋白質樣本的類型和來源、所處的狀態以及實驗目的和要求各不相同，目前并沒有一個通用的制備方法［12］。此外，在研究真菌代謝及蛋白分泌的過程中，除了大量的胞內蛋白，真菌細胞中40%的蛋白是整合在生物膜上的，具有重要的生理功能［13］，整合分析膜結合蛋白質，對于微生物代謝機理研究也至關重要。并且由于膜蛋白本身疏水性強、水溶性差、豐度低等特點，使得膜蛋白質組學的研究較為困難［14－17］。為此，許多研究者致力于膜蛋白質提取方法、增溶劑選擇及凝膠電泳體系等方面的研究，使2-DE圖譜上能夠分離得到更豐富的膜蛋白，以用于蛋白質組學研究。

由于樣品的制備效果顯著影響著雙向電泳的結果［18］，針對不同樣品可優化的可重復的操作條件也需要不斷的摸索［19］，建立優化的雙向電泳體系是蛋白質組研究的基礎。由于根霉屬微生物細胞壁結構復雜，細胞裂解相對其他屬菌株較困難，因此高效的裂解方法對于總蛋白及膜蛋白的提取和2-DE圖譜的獲得至關重要。目前針對真菌，細胞總蛋白樣品制備的常用方法包括機械法和化學法裂解細胞獲取蛋白，其中機械法包括液氮研磨法及高速珠磨法，化學裂解法包括在強堿或SDS存在下煮沸細胞，或者利用含有高濃度的尿素硫脲及表面活性劑配方中裂解細胞獲取蛋白［20－22］。其中對于絲狀真菌，采用機械法和化學裂解法相結合效果較好［22］;對于膜蛋白，目前通用的樣品制備方法不多，一般采用膜蛋白提取試劑盒或者利用表面活性劑等進行提取。ReadyPrepTMProtein Extraction Kit膜蛋白提取試劑盒是一種基于提取全細胞蛋白，再經過兩相分層提取膜蛋白的試劑盒，已報道用于酵母、細菌、植物及動物組織膜蛋白的提取［23－25］。Hama［26］和 Teng［27］也提出了根霉膜蛋白的提取方法。

華根霉(Rhizopus chinesis)CCTCC M201021，是從我國傳統釀造食品白酒大曲中分離得到的絲狀真菌，在傳統釀造過程中具有重要的作用。進一步研究發現該菌生產的膜結合脂肪酶具有較強的有機相酯合成活性［28］，可用于脂肪酶的工業生產。但是，由于根霉微生物的復雜性，其生理及發酵代謝機制尚不清楚，難以在傳統釀造及現代發酵過程中進行有效控制。因此，從分子水平入手，解析此類微生物的生理及發酵代謝機制，是一項極具意義與挑戰的研究。蛋白質組學技術為此類研究提供了有效的手段［7－11］。本研究通過比較華根霉細胞總蛋白(全細胞蛋白)及膜蛋白的不同提取方法用于雙向電泳研究，旨在建立優化的雙向電泳條件，獲得重復性好、分辨率高、無明顯條紋、具有更多蛋白信息的華根霉全細胞蛋白及膜蛋白二維圖譜，為華根霉及相關微生物的蛋白質組學研究奠定技術基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養基

菌種:華根霉(Rhizopuschinensis)CCTCCM201021，保存于中國典型培養物保藏中心。

孢子斜面培養基:馬鈴薯－葡萄糖瓊脂培養基。

發酵培養基:蛋白胨40 g/L，一水合麥芽糖10 g/L，橄欖油34 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，自然 pH。

1.1.2 試劑

IPG膠條(pH 3～10線性/pH 3～10非線性，24 cm)、兩性電解質 Bio-Lyte(pH 3～10)、礦物油、ReadyPrepTMProtein Extraction Kit為 Bio-Rad公司產品。二硫蘇糖醇(DTT)、溴酚藍、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)、硫脲、碳酸氫銨(NH4HCO3)購自Sigma公司。蛋白測定試劑盒、低熔點瓊脂糖、尿素、蛋白酶抑制劑、甲叉雙丙烯酰胺/丙烯酰胺溶液、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、3-(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸(CHAPS)、碘乙酰胺(IAA)、考馬斯亮藍G-250為上海生工產品。其他試劑均為分析純試劑，購自國藥集團試劑公司。

裂解液［29］:7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、40 g/L CHAPS、10 mg/mL DTT。

1.1.3 主要儀器

EttanTMIPGphor 3等電聚焦儀、EttanTMDALT Six垂直電泳系統、Image Scanner掃描儀，均為美國GE公司產品;立式冷凍離心機(3K15)，為德國Sigma公司;Mini-BeadBeater 16，美國Biospec公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養與制備

孢子培養:接種孢子斜面培養基，40℃下培養72 h。

孢子懸浮液的制備:用無菌生理鹽水將生長于馬鈴薯－葡萄糖瓊脂斜面的成熟華根霉孢子洗下，經兩層擦鏡紙過濾后制成孢子懸浮液，使用血球計數板計數，置于4℃待用。

菌體發酵培養:孢子懸浮液接種量5×107個/L，接種到20 mL培養基中，30℃，200 r/min，培養66 h。

菌體制備:收集發酵成熟的菌體，超純水洗3次。稱取濕菌體質量，將濕菌體與玻璃珠以1∶3質量比混合后液氮研磨至粉末狀備用。

1.2.2 細胞總蛋白提取

采用機械法和化學裂解法相結合的方法，利用不同的提取液進行全細胞蛋白提取。

裂解液提取細胞總蛋白［29］:根據文獻略有改動，將超聲破碎改為了機械振蕩破碎，具體操作如下:裂解液1 mL，加入10 μL蛋白酶抑制劑(Protein Cocktail for fungi)和兩性電解質Bio-Lyte。混合均勻后加入液氮研磨的玻璃珠與菌體的混合物0.8 g，渦旋混勻后置于mini beads beater破碎儀破碎10 min(30 s破碎，30 s冰浴)。破碎后的固液混合物于4℃放置2 h，放置期間每0.5 h拿出渦旋2 min。12 000 r/min 4℃ 離心30 min，上清即為細胞總蛋白溶液。

ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取細胞總蛋白:按照說明書操作，操作終止于兩相分層前。具體操作如下:稱取0.5 g液氮研磨后菌體與玻璃珠的混合物，加入0.5 mL的 Buffer M1，渦旋混勻后置于mini beads beater破碎10 min(30 s破碎，30 s冰浴)。加入0.5 mL的Buffer M2，冰水浴，每隔60 s渦旋混勻60 s，重復5次，再冰水浴1 h，得到的固液混合物12 000 r/min 4℃ 離心30 min，上清液即為細胞總蛋白溶液。

1.2.3 膜蛋白提取

ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取膜蛋白:由于該試劑盒可進一步提取膜蛋白，將1.2.1中試劑盒提取細胞總蛋白溶液置于37℃保溫30 min，每隔10 min漩渦振蕩30 s;室溫下，12 000 r/min離心5 min。下層即為提取的膜蛋白。

曲拉通X-100提取華根霉(Rhizopus chinensis)膜蛋白［26－27］:將發酵培養 66 h的華根霉菌體，研缽研磨并稱重，丙酮與菌體以10∶1(體積質量比)的比例混合，置于磁力攪拌器上攪拌20 min洗去油脂，抽濾獲得菌體干粉;以10∶1的體積質量比加入濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.2)，于4℃下磁力攪拌20 min，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復以上操作3次;加入與上述磷酸緩沖液等體積的0.1% 的 Triton X-100，4℃下磁力攪拌器攪拌20 min，4℃ 10 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復上述操作1次;加入上述等體積的1.5% 的Triton X-100，4℃磁力攪拌4 h，4℃ 10 000 r/min離心30 min，上清液即為膜蛋白溶液。

1.2.4 電泳樣品預處理

TCA/丙酮沉淀蛋白:獲得的蛋白溶液轉移到50 mL離心管中，加入10倍體積的10%TCA/丙酮溶液，－20℃沉淀過夜，4℃ 12 000 r/min離心30 min，棄上清液;用等體積的丙酮懸浮洗滌沉淀，－20℃放置1 h，4℃12 000 r/min離心30 min，棄上清液，重復3次。得到沉淀的蛋白質，揮發掉丙酮后，即得到蛋白樣品。

蛋白定量:將蛋白沉淀溶于上樣水化液(7 mol/L尿素、2 mol/L 硫脲、40 g/L CHAPS、2 g/L 的 Bio-Lyte、65 mmol/L DTT、0.02 g/L 溴酚藍)中，4 ℃放置3 h，每0.5 h漩渦振蕩5 min(30 s冰浴，30 s振蕩)，4℃12 000 r/min離心30 min，使用非干擾型蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 雙向電泳

操作過程按照美國GE公司的《雙向電泳操作手冊》進行，采用24 cm、pH 3～10的膠條(線性/非線性)，上樣體積 450 μL，細胞總蛋白上樣量 1 080 μg，膜蛋白上樣量600 μg，20℃被動水化12 h。轉向等電聚焦，采用電壓逐步優化方案優化等電聚焦程序，等電聚焦結束后立即進行膠條平衡，然后以恒功率進行二向SDS-PAGE，采用質量分數為12.5%丙烯酰胺凝膠，當溴酚藍跑到凝膠底部時停止電泳，采用改良的考馬斯亮藍G-250染色法進行染色。GE公司的凝膠電泳圖像分析系統Image Master Lab Scan掃描脫色后的凝膠，利用Bio-Rad公司的PDQuest 8.0.1軟件分析處理圖像。

2 結果與討論

2.1 華根霉細胞總蛋白2-DE圖譜的建立

本研究首先針對細胞總蛋白，利用兩種細胞總蛋白提取方法，ReadyPrepTMProtein Extraction Kit與普通的裂解液提取法進行了華根霉細胞總蛋白的提取，用于2-DE分析。對兩種提取方法提取細胞總蛋白的雙向電泳效果作了比較，兩種方法提取的細胞總蛋白2-DE圖譜如圖1所示。

由圖1可見，采用試劑盒提取的細胞總蛋白2-DE圖譜分辨率較高，較清晰，橫縱條紋較少，無拖尾現象。對獲得的二維圖譜用PDQuest 8.0.1軟件進行分析，結果如圖2所示。試劑盒提取的細胞總蛋白在2-DE圖譜上的蛋白點數可以覆蓋裂解液提取得到蛋白點的86.1%，表明試劑盒可以提取大部分裂解液提取的細胞總蛋白點。此外，試劑盒提取的細胞總蛋白點比裂解液提取得到的蛋白點多了95個，說明試劑盒提取華根霉細胞總蛋白的效果較好，獲得的2-DE圖譜更加理想，可以得到更多的蛋白種類信息。

圖1 不同提取方法華根霉細胞總蛋白2-DE圖譜Fig.1 2-DE maps of Rhizopus chinesis total protein extracted by different extraction methods

圖2 兩種提取方法得到的2-DE圖譜蛋白點差異Fig.2 Difference of protein points on 2-DE maps by different extraction methods

預制膠條pH值范圍也是影響雙向電泳2-DE圖譜結果的重要因素之一。寬pH值范圍的IPG膠條，對于蛋白的覆蓋率大，但是分辨度相對較低，而窄pH值范圍的IPG膠條，雖然可以提高分辨率及靈敏度，但是會有部分蛋白丟失［30］。由圖1可以發現，華根霉細胞總蛋白點主要集中在pH 4～7之間，在堿性端也有一些蛋白點。為了使蛋白點能夠在較少損失的前提下，實現更有效的分離，獲得分辨度高的理想2-DE圖譜，本研究針對試劑盒提取的華根霉細胞總蛋白，進一步比較了pH 3～10線性與非線性IPG膠條的分離效果，其2-DE圖譜如圖3所示。可以看出，pH 3～10非線性IPG膠條的使用更加有利于蛋白的分離，蛋白點分布均勻，圖譜分辨率高(圖3(b))。

圖3 細胞總蛋白2-DE圖譜pH梯度優化Fig.3 Optimization of pH gradient on 2-DE maps of total protein

為驗證2-DE圖譜的重復性，采用上述建立的優化方法，利用試劑盒提取總蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條，進行了3次生物學重復，獲得的3次重復結果如圖4。從結果來看，細胞總蛋白樣品的3次重復實驗獲得的2-DE圖譜蛋白分離效果均較好，分辨率較高。利用PDQuest 8.0.1軟件分析，細胞總蛋白重復樣品間的蛋白斑點匹配度可以達到87%，表明利用優化后的實驗條件可以最終獲得分辨率高、重復性好的華根霉總蛋白2-DE圖譜，可用于其蛋白質組學研究。

圖4 華根霉總蛋白2-DE重復性驗證Fig.4 Repeatability of 2-DE maps on the total proteins extracted from Rhizopus chinesis

2.2 華根霉膜蛋白2-DE圖譜的建立

為了獲得更豐富的膜蛋白信息，針對華根霉膜蛋白，分別利用 ReadyPrepTMProtein Extraction Kit和Triton X-100兩種方法提取膜蛋白。但是該試劑盒未能實現華根霉膜蛋白的提取，由于該試劑盒主要適用于酵母、細菌及動植物組織，對于絲狀真菌華根霉可能并不適合，也可能由于本實驗菌株華根霉菌體細胞內油脂含量比較高，試劑盒提取液無法在特定條件下分離膜蛋白。而采用Triton X-100提取得到了較好的膜蛋白樣品，可用于雙向電泳分析。

同樣比較了pH 3～10線性與非線性IPG膠條對于Triton X-100提取的膜蛋白雙向電泳的分離效果，結果如圖5。選用pH 3～10線性的IPG膠條時，蛋白點主要集中在pH 4～7區域范圍內，影響了蛋白點的分離及膠圖的美觀。選用pH 3～10非線性的IPG膠條，蛋白點分布更加均勻，有利于蛋白的分離，獲得的圖譜更加清晰，分辨率較好。用PDQuest 8.0.1軟件分析，檢測到蛋白點增加了43.6%。因此，對于膜蛋白也采用非線性的IPG膠條進行分離。

為驗證華根霉膜蛋白2-DE圖譜的重復性，利用Triton X-100提取膜蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條的優化方法，同樣進行了3次生物學重復，獲得的3次重復結果如圖6。從結果來看，膜蛋白樣品的3次重復實驗獲得的2-DE圖譜蛋白分離效果也均較好，分辨率較高。利用PDQuest 8.0.1軟件分析，膜蛋白重復樣品間的蛋白斑點匹配度高達94%，表明利用優化后的實驗條件可以最終獲得分辨率高、重復性好的華根霉膜蛋白2-DE圖譜，可用于其蛋白質組學研究。

圖5 膜蛋白2-DE圖譜pH梯度優化Fig.5 Optimization of pH gradient on 2-DE maps of membrane protein

2.3 華根霉細胞總蛋白與膜蛋白2-DE的相關性分析

由于試劑盒的方法提取的細胞總蛋白可能含有膜蛋白，本研究將試劑盒提取的細胞總蛋白樣品與膜蛋白樣品的2-DE圖譜進行了比較分析。利用PDQuest 8.0.1軟件比較分析結果顯示，細胞總蛋白2-DE圖譜上共有蛋白點741個，膜蛋白2-DE圖譜上共有蛋白點274個，蛋白點匹配情況如圖7，說明用試劑盒提取細胞總蛋白樣品可以提取分離一定量的膜蛋白，但是相較于單獨提取的膜蛋白樣品，仍有約45.3%的膜蛋白無法體現在細胞總蛋白2-DE圖譜上。結果表明，試劑盒提取細胞總蛋白樣品除了大量的胞內蛋白外，也包含部分膜蛋白;可以用于一般的差異蛋白質組學研究;而本研究膜蛋白提取方法可以獲得較為豐富的華根霉膜蛋白，更適合于膜蛋白質組學研究。

圖6 華根霉膜蛋白2-DE重復性驗證Fig.6 Repeatability of 2-DE maps on the membrane proteins extracted from Rhizopus chinesis

圖7 細胞總蛋白與膜蛋白2-DE圖譜蛋白點匹配Fig.7 Protein points matching on 2-DE maps of total proteins and membrane proteins

3 結論

本研究針對絲狀真菌華根霉細胞總蛋白和膜蛋白，分別比較了不同蛋白樣品的提取方法，并通過IPG膠條的pH梯度優化，獲得了可用于蛋白質組學研究的較理想的2-DE圖譜。分別采用ReadyPrepTMProtein Extraction Kit試劑盒提取細胞總蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條;Triton X-100提取膜蛋白，選用pH 3～10非線性IPG膠條，可獲得有效分離、較清晰、分辨度高的華根霉細胞總蛋白和膜蛋白2-DE圖譜。3次生物學重復實驗，細胞總蛋白重復樣品間和膜蛋白重復樣品間的蛋白斑點匹配度分別達到87%和94%，表明該方法重復性好。蛋白點匹配分析表明，利用ReadyPrepTMProtein Extraction Kit提取的細胞總蛋白用于雙向電泳可以分離得到一定量的膜蛋白，總蛋白點數優于普通裂解液提取的細胞總蛋白，可以用于一次實驗同時獲得豐富胞內蛋白及部分膜蛋白信息的蛋白質組學研究，且經濟省時。而膜蛋白提取方法可以獲得較為豐富的華根霉膜蛋白，若想獲得更加全面的膜蛋白信息，這種方法更為適合。本研究為基于蛋白質組學研究華根霉及相關微生物生理代謝機制奠定了技術基礎。

［1］ Gibbs P A，Seviour R J，Schmid F.Growth of filamentous fungi in submerged culture:Problems and possible solutions［J］.Critical Reviews in Biotechnology，2000，20(1):17－48.

［2］ Dufosse L，Fouillaud M，Caro Y，et al.Filamentous fungi are large-scale producers of pigments and colorants for the food industry［J］.Current Opinion in Biotechnology，2014，26:56－61.

［3］ Hevekerl A，Kuenz A，Vorlop K D.Filamentous fungi in microtiter plates-an easy way to optimize itaconic acid production with Aspergillus terreus［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98(16):6 983 － 6 989.

［4］ Perez-Rodriguez N， Oliveira F， Perez-Bibbins B， et al.Optimization of xylanase production by Filamentous Fungi in solid-state fermentation and scale-up to horizontal tube bioreactor［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，173(3):803 －825.

［5］ SHI X Z，SHA Y，Kaminskyj S.Aspergillus nidulans hypA regulates morphogenesis through the secretion pathway［J］.Fungal Genetics and Biology，2004，41(1):75 －88.

［6］ 邵臣斌，朱華躍，蔣茹，等.絲狀真菌形態控制的分子機制研究［J］.食品科技，2013(7):20－23.

［7］ Bruneau J M，Magnin T，Tagat E，et al.Proteome analysis of Aspergillus fumigatus identifies glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins associated to the cell wall biosynthesis［J］.Electrophoresis，2001，22(13):2 812 － 2 823.

［8］ Kim Y，Nandakumar M P，Marten M R.Proteome map of Aspergillus nidulans during osmoadaptation［J］.Fungal Genetics and Biology，2007，44(9):886 － 895.

［9］ Oda K，Kakizono D，Yamada O，et al.Proteomic analysis of extracellular proteins from Aspergillus oryzae grown under submerged and solid-state culture conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72(5):3 448 －3 457.

［10］ Ouyang H M，LUO Y M，ZHANG L，et al.Proteome analysis of Aspergillus fumigatus total membrane proteins identifies proteins associated with the glycoconjugates and cell wall biosynthesis using 2D LC-MS/MS［J］.Molecular Biotechnology，2010，46(3):317 －319.

［11］ Vodisch M，Scherlach K，Winkler R，et al.Analysis of the Aspergillus fumigatus proteome reveals metabolic changes and the activation of the pseurotin a biosynthesis gene cluster in response to hypoxia［J］.Journal of Proteome Research，2011，10(5):2 508 －2 524.

［12］ Knigge T，Letendre J，Monsinjon T.Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis:Considering the composition of biological material［J］.Proteomics，2013，13(21):3 106－3 108.

［13］ Roobol-Boza M，Dolby V，Doverskog M，et al.Membrane protein isolation by in situ solubilization，partitioning and affinity adsorption in aqueous two-phase systems-purification of the human type 1 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase［J］.Journal of Chromatography A，2004，1 043(2):217－223.

［14］ Bunai K，Yamane K.Effectiveness and limitation of twodimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives［J］.Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2005，815(1 －2):227 －236.

［15］ Griffiths L G，Choe L，Lee K H，et al.Protein extraction and 2-DE of water and lipid-soluble proteins from bovine pericardium，a low-cellularity tissue［J］.Electrophoresis，2008，29(22):4 508 －4 515.

［16］ Rabilloud T.Membrane proteins and proteomics:Love is possible，but so difficult［J］.Electrophoresis，2009，30(supplement 1):S174－S180.

［17］ TAN S，TAN H T，Chung M C M.Membrane proteins and membrane proteomics［J］.Proteomics，2008，8(19):3 924－3 932.

［18］ 孔令瓊，管政兵，張波，等.黃酒麥曲浸提液中宏蛋白質組的制備［J］.食品與發酵工業，2012，38(3):7－11.

［19］ 趙紹輝，周景文，堵國成，等.釀酒酵母蛋白質雙向電泳條件優化及圖譜建立［J］.食品與生物技術學報，2014(3):235－240.

［20］ ZHANG L，FENG D Q，FANG W X，et al.Comparative proteomic analysis of an Aspergillus fumigatus mutant deficient in glucosidase I(AfCwh41)［J］.Microbiology-Sgm，2009，155:2 157 －2 167.

［21］ Nandakumar M P，Marten M R.Comparison of lysis methods and preparation protocols for one-and two-dimensional electrophoresis of Aspergillus oryzae intracellular proteins［J］.Electrophoresis，2002，23(14):2 216 － 2 222.

［22］ 胡彬彬，林連兵，魏云林，等.一種高效的真菌總蛋白質提取方法［J］.中國生物工程雜志，2013(9):53－58.

［23］ Jastorff A M，Haegler K，Maccarrone G，et al.Regulation of proteins mediating neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］.Proteomics Clinical Applications，2009，3(11):1 273 － 1 287.

［24］ BAO S J，GUO X Q，YU S Q，et al.Mycoplasma synoviae enolase is a plasminogen/fibronectin binding protein［J］.Bmc Veterinary Research，2014，10:223.

［25］ Kovach Z，Kaakoush N O，Lamb S，et al.Immunoreactive proteins of Campylobacter concisus，an emergent intestinal pathogen［J］.Fems Immunology and Medical Microbiology，2011，63(3):387 －396.

［26］ Hama S，Tamalampudi S，Fukumizu T，et al.Lipase localization in Rhizopus oryzae cells immobilized within biomass support particles for use as whole-cell biocatalysts in biodiesel-fuel production［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，101(4):328 －333.

［27］ TENG Y，XU Y，WANG D.Production and regulation of different lipase activities from Rhizopus chinensis in submerged fermentation by lipids［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2009，57(1 －4):292 －298.

［28］ XU Y，WANG D，MU X Q，et al.Biosynthesis of ethyl esters of short-chain fatty acids using whole-cell lipase from Rhizopus chinesis CCTCC M201021 in non-aqueous phase［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2002，18(1－3):29－37.

［29］ ZHAO S H，ZHAO X R，ZOU H J，et al.Comparative proteomic analysis of Saccharomyces cerevisiae under different nitrogen sources［J］.Journal of Proteomics，2014，101:102－112.

［30］ 葉妙水，鐘克亞，胡新文，等.雙向凝膠電泳的實驗操作及進展［J］.生物技術通報，2006(3):5－10.