發酵劑發酵、自然發酵與未發酵黑米煎餅的風味物質分析

唐明禮，王勃，劉賀，何余堂，惠麗娟，馬濤

(渤海大學化學化工與食品安全學院，渤海大學糧油科學與技術研究所，遼寧錦州，121013)

煎餅是中國傳統的谷物發酵食品之一，由五谷雜糧磨成的面糊攤烙而成。制作煎餅的原料極為廣泛，傳統的多以粗雜糧為主并在一定程度上保留了籽粒的糊粉層、胚和胚乳等天然成分，故煎餅是全谷物制品，具有較高的營養價值［1-2］。

目前煎餅的制作多以傳統作坊式自然發酵生產，但生產效率低、產品質量不穩定、生產過程易受微生物二次污染，從而使得其食品質量安全堪憂。為解決上述問題，研究者將發酵過程中的優勢乳酸菌和酵母菌制成混合發酵劑用于煎餅生產。研究發現由乳酸菌和酵母菌復合發酵劑生產的產品具有較長的貨架期、延緩老化、抑制霉菌腐敗、改進產品的感官性質、具有更多的揮發性物質、縮短發酵周期，有利于實現工業化，提高產品質量等優點［3-5］。

煎餅的味道是消費者接受和認可該產品的重要屬性，故生產與自然發酵煎餅風味接近的菌種發酵煎餅勢在必行。很多因素共同影響煎餅的風味，如面糊發酵有助于醇、酸、酯的形成［6］;酶產生的前體物質直接或間接地參與了風味的形成［7］;焙烤期間熱誘導的美拉德反應及脂質氧化反應等都有助于產品的最終風味［8］。盡管非揮發性成分能提供甜、酸、苦、咸等基本味道，但揮發性成分具有較低的閾值，盡管濃度較低，但顯著影響食品的整體風味，最終影響產品的質量［9］。

本實驗利用電子鼻技術分析未發酵、自然發酵和發酵劑發酵煎餅風味上的差異，確定與自然發酵煎餅風味最為接近的菌種組合，應用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法提取黑米煎餅中的揮發性成分進行分析，進一步明確發酵劑與自然發酵的黑米煎餅的異同。

1 材料與方法

1.1 材料

煎餅專用發酵菌種由戊糖片球菌、腸膜明串珠菌和釀酒酵母組成，皆由渤海大學糧油科學與技術研究所提供;煎餅，本溪寨香生態農業有限公司提供(蛋白質:11.5 g/100g、脂肪:2.8 g/100g、碳水化合物:72.5 g/100g、水分:13.2 g/100g);4-甲基-2-戊醇標準品，Sigma公司;MRS培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司;YEPD培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司;NaCl，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PEN3便攜式電子鼻，德國AIRSENSE公司;固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶，美國Supelco公司;Agilent 7890N/5975氣質聯用(GC-MS)儀，美國 Agilent公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 煎餅制作的操作要點

挑選子粒飽滿的黑米、大米和大豆為主要實驗原料，其比例為12∶7∶1，將黑米和大豆浸泡10 h，精白米加1.5倍水蒸煮30 min，與浸泡好的黑米和大豆混合，將上述混合物用膠體磨粉碎，然后在26℃發酵10 h，堿中和pH至6.8，攤制溫度180℃條件進行烙制。

對煎餅面糊進行酵母菌和乳酸菌數量進行檢測，確定黑米發酵面糊中乳酸菌與酵母菌的比例為1.5∶1。在發酵劑用量為3%的前提下，戊糖片球菌與腸膜明串珠菌的比例為 1∶2、1∶1、2∶1，確定與自然發酵黑米煎餅風味最為接近的乳酸菌比例。

1.3.2 電子鼻檢測確定菌種比例

在煎餅不同部位準確稱取2.000 g放在離心管中，迅速用保鮮膜封口在室溫條件下平衡30 min。電子鼻的測定時間為120 s，清洗時間:110 s，樣品間隔:1 s，傳感器室流量:350 mL/min，測量樣品流量:350 mL/min。每個樣品重復測定3次。PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述見表1。

表1 PEN3型便捷式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

1.3.3 GC-MS分析

應用頂空固相微萃取聯合氣相色譜-質譜分析揮發性化合物。固相微萃取:在煎餅不同部位準確稱取2.000 g樣品切碎于20 mL的頂空瓶中，加入6 mL的20%的 NaCl溶液、5 μL 的 4-甲基-2-戊醇內標溶液和磁轉子，用聚四氟乙烯隔墊密封，在60℃的磁力攪拌器中加熱平衡20 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取頭(270℃活化60 min)頂空吸附60 min，將萃取頭插入 GC進樣口解吸5 min［10-11］。每個樣品重復實驗2次。

氣相色譜條件:HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為250℃，不分流模式進樣;載氣為He，流速1.0 mL/min;程序升溫:柱初溫35℃，保持5 min，以5℃/min升至 50℃，保持5 min，再以5.5℃/min升至230℃，保持5 min。

質譜條件:色譜-質譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃;離子化方式:EI;電子能量70 eV;質量掃描范圍 30 ～550(m/z)［10-11］。

1.4 數據分析

樣品中揮發性成分的定性分析采用計算機譜庫(NIST11/Wiley 7.0)進行檢索，樣品中揮發性化合物的濃度通過與內標物的濃度比較進行測定。

式中:C，4-甲基-2-戊醇的濃度，mL/mg;V，4-甲基-2-戊醇的體積，μL;A1，揮發物的峰面積，mV·min;M，樣品質量，g;A2，4-甲基-2-戊醇的面積，mV·min。

2 結果與分析

2.1 電子鼻檢測與自然發酵煎餅口感相近的乳酸菌比例

采用電子鼻檢測與自然發酵煎餅口感相近的菌種比例，結果如圖1～圖3。圖1為未發酵、自然發酵、發酵劑發酵黑米煎餅的主成分分析，其主成分1(PC1，95.06%)和主成分2(PC2，3.46%)的累積方差貢獻率為98.52%，說明PC1和PC2包含很大的信息量，基本能夠反映樣品的信息特征。從圖中可看出，發酵劑中戊糖片球菌與腸膜明串珠菌1∶1的與自然發酵黑米煎餅的口感最為接近，而其他的比例與自然發酵的黑米煎餅分布于各自的區域，能很好地被電子鼻區分。

圖1 未發酵、自然發酵、發酵劑生產黑米煎餅的PCA分析Fig.1 PCA analysis of black rice pancake produced by unfermentation，natural fermentation，leavening agents

圖2為未發酵、自然發酵、發酵劑生產黑米煎餅的線性判別式分析，第一主成分和第二主成分總的區分貢獻率達95.79%。第一主成分區分貢獻率達83.09%，第二主成分區分貢獻率達12.70%，從圖中可看出，LDA分析可以區分各樣品間的差異，但發酵劑中戊糖片球菌與腸膜明串珠菌1∶1的與自然發酵的煎餅間距離最短，兩種煎餅間風味差異最小，其他均與自然發酵煎餅風味差異較大。

圖2 未發酵、自然發酵、發酵劑生產黑米煎餅的LDA分析Fig.2 LDA analysis of black rice pancake produced by unfermentation，natural fermentation，leavening agents

圖3為電子鼻10個傳感器分別對樣品的PCA主成分分析的貢獻率。R(2)傳感器對第一主成分區分貢獻率最大，是第一主成分的特征信號;R(9)傳感器對第二主成分區分貢獻率最大。根據各傳感器對不同物質的特異敏感度，R(2)和R(9)傳感器對不同煎餅風味差異具有主要貢獻。

圖3 未發酵、自然發酵、發酵劑生產黑米煎餅的Loading分析Fig.3 Loading analysis of black rice pancake produced by unfermented，natural fermented，leavening agents

2.2 GC-MS分析結果

采用固相微萃取對未發酵、發酵劑發酵和自然發酵黑米煎餅的香氣成分進行萃取，經氣相色譜-質譜聯用儀分析鑒定，由GC-MS工作站繪出未發酵和自然發酵玉米煎餅香氣成分的總離子流圖見圖4、5和6。

未發酵、自然發酵、發酵劑發酵的黑米煎餅中揮發性成分組成及相對含量見表2，共鑒定出55種揮發性物質，未發酵黑米煎餅檢測出21種揮發性物質，發酵劑制作的黑米煎餅檢測出34種揮發性物質，自然發酵黑米煎餅檢測出39種揮發性物質。這些揮發性物質主要包括醛類、酮類、酯類、醇類、烴類和芳香族化合物等，這些物質共同構成了黑米煎餅的獨特風味，這些化合物可能源于面糊的發酵、酶反應以及攤制過程中的美拉德反應和脂質氧化反應［12］。

圖4 未發酵黑米煎餅的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of black rice pancake produced by unfermentation

圖5 發酵劑發酵黑米煎餅的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of black rice pancake produced by leavening agents

圖6 自然發酵黑米煎餅的總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of black rice pancake produced by natural fermentation

2.2.1 羰基化合物

羰基化合物包括醛類和酮類物質，在煎餅等產品中有重要的作用。微量醛可使食品香氣更加醇厚，如壬醛有令人愉快的香味，存在于檸檬草油、玫瑰油、肉桂油等物質中［13］。己醛是一種具有青草氣及蘋果香味的成分，天然品存在于蘋果、草莓中［14］;苯甲醛具有特殊的杏仁氣味，用于配制杏仁、櫻桃、果仁等型香精［15］;苯乙醛具有玫瑰花香［16］。其他如乙醛、丁醛、戊醛等均有助于發酵食品香氣的形成［13］。在3種煎餅中共檢測出12種醛類化合物，在未發酵煎餅、發酵劑發酵和自然發酵煎餅中分別檢測出6種，10種和7

種醛類物質。發酵后增加了正辛醛、庚醛、苯甲醛、反，反-2，4-癸二烯醛、反-2-壬烯醛、反-2-十二烯醛，這可能是由于面糊發酵過程中微生物的發酵作用所致。發酵劑發酵比自然發酵增加了庚醛、2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛，這可能是由于發酵劑的代謝產物和其它物質發生了某種化學發應。

表2 不同黑米煎餅揮發性物質的GC-MS分析結果Table 2 Composition of volatile flavor compounds in different black rice pancake determined by GC-MS

未發酵、發酵劑發酵和自然發酵3種煎餅共檢測出2、5、6種酮類物質，說明發酵后酮類物質也有所增加，自然發酵比發酵劑發酵增加了2-庚酮，這可能是面糊中除發酵劑菌種外其他乳酸菌和酵母菌產生的代謝產物。從表2看出香葉基丙酮存在發酵黑米煎餅中，其含量為 294.607、54.561 μg/kg。具有青香、果香和木香等味道，對黑米煎餅產生積極影響。羰基類化合物在所檢成分中占有較大比例，是黑米煎餅風味的主要來源。

2.2.2 醇、酸和酯類化合物

3種黑米煎餅中共檢測出9種醇、1種酸和4種酯類化合物，占總揮發性成分的15.2%、1.4%和6.8%。發酵劑發酵的黑米煎餅揮發物種類小于自然發酵，原因可能是發酵劑在發酵過程中作為優勢菌種會抑制其他菌種的生長及代謝，最終導致代謝產物減少，揮發性物質減少。醇類都具有芳香、植物芳香等特殊香氣，對賦予發酵黑米煎餅香氣作用較大，而且與其他成分間存在相乘作用，如苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰花香，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香味和強烈的藥草香韻，也是香料行業中一種有價值的合成香料［17-19］，盡管醇類的閾值較高，但醇類物質可以與有機酸形成酯類物質，有利于黑米煎餅風味物質的形成［20］。酸類化合物只檢測到醋酸，均存在3種產品中且發酵后均有不同程度的增加。研究發現，一些有機酸在高溫下與醇類反應生成酯類，一部分酯類可成為特有化合物［21］。由表2可知，發酵前后醇和酯類化合物均有一定程度的增加，酸類物質沒有發生變化。研究發現與單一發酵劑相比，酵母菌和乳酸菌共同發酵會形成更多的風味物質［22］。

2.2.3 烯烴、烷烴類化合物

根據表2烷烴類化合物的含量在所有檢測的揮發性化合物中含量最高。烷烴類化合物在發酵后數量和種類明顯增強，十一烷基-環戊烷和十四烷均存在于發酵劑發酵和自然發酵的煎餅中。正十五烷、正十七烷、3-甲基-二十一烷存在于發酵劑發酵煎餅中，十一烷基-環戊烷、1，1＇-(2-甲基-1，3-丙二基)雙環己烷、順式-1-(環己基甲基)-4-乙基-環己烷、十四烷、5-甲基-十四烷存在于自然發酵煎餅中，自然發酵比發酵劑發酵煎餅的烷烴種類多，可能是由于自然發酵面糊中微生物種類較多，不同種類代謝產物可發生復雜的生化反應及在攤制過程美拉德反應導致。

2.2.4 芳香類化合物

芳香類化合物是煎餅等產品的重要化合物，3種煎餅產品中共檢測到3種芳香類化合物，未發酵煎餅中檢測到種2芳香類化合物，其4-仲丁基苯酚含量最高，含量為377.157 μg/kg，發酵劑發酵黑米煎餅中檢測到2種芳香類化合物，其2-正戊基呋喃含量最高，含量為2 402.585 μg/kg，自然發酵的黑米煎餅共檢測到3種芳香類化合物，其4-仲丁基苯酚含量最高，含量為 359.700 μg/kg。

3 結論

本實驗利用電子鼻及GC-MS技術確定了發酵劑生產黑米煎餅的菌種比例及對發酵劑與自然發酵黑米煎餅的揮發性風味物質進行了分析，對發酵劑在黑米煎餅生產中的應用進行了評價。

利用戊糖片球菌與腸膜明串珠菌比例為1∶1的發酵劑發酵得到的煎餅與自然發酵黑米煎餅的口感最為接近。發酵后揮發性化合物種類明顯增多。醛類和酮類揮發性物質對黑米煎餅風味起關鍵作用，其數量及種類較多，是煎餅風味物質的主體風味物質。發酵劑發酵與自然發酵的黑米煎餅中酮類和醇類揮發物種類相似，烷烴和芳香類化合物數量相近。故由戊糖片球菌、腸膜明串珠菌和酵母菌制成的混合發酵劑可用于煎餅的連續化及工業化生產。

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