工業化發酵生產普魯蘭多糖的提取條件優化

萬玉軍，唐曉芳，李鎮江，王剛，，楊曉琴，鄭君，黃偉，江源鋼，王宏

1(四川省食品發酵工業研究設計院，四川成都，611130)

2(成都金開生物工程有限公司，四川成都，611130)

普魯蘭多糖是一種特殊的微生物胞外多糖，是由出芽短桿霉發酵產生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質多糖［1-3］。因其水溶性好、溶液黏稠穩定、優良的增稠作用［4-5］、無色無味無毒性、安全性好等特點［6］，已被廣泛用于醫藥、食品、輕工、化工和石油［7-9］等領域，另外在煙草工業、農業種子保護等領域［10-11］也逐步被應用，是一種很有前景的工業用多糖。但目前尚未實現規?；a，原因在于普魯蘭多糖菌種產率低、發酵提取工藝有較大的局限性，比如如何除雜(菌體以及無機鹽、有機殘余物)、脫色(發酵液中色素沉積過多)、去蛋白(保留目的產物，去除雜蛋白)等問題［12-14］。篩選出了1株產率可達68～71 g/L的普魯蘭多糖高產菌株，已經用于5 t發酵罐規模的生產。本實驗通過對普魯蘭多糖5 t發酵罐規模發酵后，對普魯蘭多糖提取過程中所遇到的難點進行研究，旨在解決提取問題，為工業化生產提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菌株:出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A-22菌株，來源于成都金開生物公司實驗室。

普魯蘭發酵液。

1.2 實驗試劑

NaOH、HCl、乙醇、H2SO4等均為分析純試劑，成都市科龍試劑化工廠生產。

1.3 實驗儀器

壓濾機、超濾膜設備、NDJ-8S數字式黏度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠;UV1800PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 提取工藝流程

發酵液預處理→除菌體雜質→活性炭脫色→樹脂(脫色、去蛋白)→超濾→干燥

1.4.2 發酵液預處理

發酵結束后，發酵液經過80℃高溫滅酶，稀釋到2%，用于后續實驗。

1.4.3 硅藻土的選型、用量

選取兩種硅藻土進行過濾，預處理過后的發酵液分成等體積的3份，硅藻土的量選擇1%、2%、3%，制成厚度不同的濾餅層，進行板框過濾，過濾后，測定發酵液的澄清度(透過率)和含糖量。

1.4.4 活性炭對普魯蘭多糖脫色效果實驗

1.4.4.1 活性炭的用量

取等體積的經除菌后的發酵液6份，在自然pH，溫度40℃，脫色時間30 min，攪拌條件下，活性炭的用量分別為 0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%(活性炭用量/發酵液體積)，經過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.2 活性炭脫色時間

取等體積的經除菌后的發酵液6份，在活性炭用量為0.5%，自然pH，溫度40℃，攪拌條件下，篩選脫色時間為20、30、40、50、60、70 min 時脫色效果，經過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.3 活性炭脫色溫度

取等體積的經除菌后的發酵液6份，在活性炭用量為0.5%，自然pH，脫色時間為40 min，攪拌條件下，篩選溫度為 30、40、50、60、70、80 ℃時脫色效果，經過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.4.4.4 活性炭脫色pH

取等體積的經除菌后的發酵液6份，在活性炭添加量為0.5%，溫度50℃，脫色時間為40 min，攪拌條件下，篩選 pH 為4.5、5、5.5、6、6.5、7 時脫色效果，經過濾后，在吸光度420 nm條件下測定吸光值，得出普魯蘭多糖的脫色率、損失率。

1.5 吸附樹脂選型

活性炭對發酵液脫色后，用樹脂進行進一步脫色、去蛋白。在實驗過程中，選用了5種樹脂進行實驗。分別裝相同柱高，選用活性炭脫色完的發酵液，每份體積相同，過柱，過完之后，觀察顏色，得出多糖的得率、損失率及測定含氮量，選擇作用明顯的樹脂。

1.6 超濾

過完樹脂后的發酵液，濃度為1.5%，進行超濾，體積濃縮為4%，再次加入等體積的純水，超濾。同樣的操作進行5次，超濾完后，計算發酵液中的單二寡糖的含量及多糖損失率。

1.7 干燥方式的選擇

取等體積超濾完的發酵液4份(配制成5%的濃度)，分別采用冷凍干燥、噴霧干燥、滾筒干燥、微波真空干燥4種干燥方式，對其進行干燥。分析干燥成本，干燥完之后看產品的復溶性(取3 g溶于100 mL水，置于攪拌器上，800 r/min攪拌至完全溶解)。

1.8 分析方法

1.8.1 發酵液多糖的測定

普魯蘭多糖含量的測定:樣品中普魯蘭多糖的定量分析采用高效液相色譜進行測定。流動相A:水;流動相 B:乙腈，其比例7∶3。取一定體積的樣品，經過離心，取一定體積的上清液(普魯蘭多糖含量在0.200～0.300 g)，加100 μL普魯蘭酶，定容至50 mL。在58℃下酶解4 h，經0.45 μm膜過濾備用。進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min。利用標準曲線求普魯蘭多糖的含量。

1.8.2 發酵液的黏度測定

采用NDJ-8S數字式黏度計測定。

1.8.3 色素的測定

樣品中色素測定通過UV1800PC型紫外可見分光光度計在420nm處的吸光值表示。

1.8.4 樣品中含氮量測定

凱氏定氮法［16］。

1.8.5 單二寡糖測定［7］

硫酸蒽酮法。單二寡糖去除率:(超濾前單二寡糖含量-超濾后單二寡糖含量)/超濾前單二寡糖含量 ×100)。

1.8.6 普魯蘭多糖的灰分測定［17］

灼燒殘渣法。

1.8.7 普魯蘭多糖的含水量測定［18］

直接干燥法。

1.8.8 普魯蘭多糖的黏度測定［7］

2 實驗結果和分析

2.1 硅藻土的選型、用量

硅藻土的用量如表1所示，壓濾后的發酵液的澄清度(透過率)和多糖得率，確定硅藻土的型號及用量。

表1 助濾劑添加量對助濾效果的影響Table 1 The effect of diatomaceous earth dosage on filter

從表1可以看出，因為普魯蘭多糖性質特殊，所以濾餅層硅藻土型號和用量的不同直接影響發酵液的澄清度和目的產物的得率，實驗結果表明，以1號硅藻土作為助濾劑，用量2%，此時普魯蘭多糖的得率高、澄清度較好。

2.2 活性炭用量、脫色時間、脫色溫度、脫色最適pH

2.2.1 活性炭的用量

活性炭是多孔性固體吸附劑，吸附能力較強。如圖1所示，隨著活性炭的用量不斷加大，脫色率逐漸增大，脫色效果較好，用量超過0.5%，脫色效果不穩定?；钚蕴苛康募哟?，多糖的損失率不斷增大，可能是活性炭吸附多糖，造成一定損失。選擇用量為0.5%，既能達到良好的脫色效果，節約活性炭用量，同時還可以降低多糖的損失。

圖1 不同用量的活性炭對脫色的影響Fig.1 The influence of different dosage of active carbon decoloring effect

2.2.2 活性炭脫色時間

如圖2所示，隨著時間的延長，40 min時是脫色效果最好，此時可能已達到活性炭吸附色素的飽和度，60 min以后脫色效果有所下降，可能是時間太長，導致發酵液中小分子糖發生褐變反應，反而有色素產生，影響脫色效果。因此選擇最適脫色時間為40 min。

圖2 脫色時間對活性炭脫色效果的影響Fig.2 Different time on the decoloring effect of activated carbon

2.2.3 活性炭脫色溫度

如圖3所示，溫度對活性炭脫色影響較明顯，在溫度較低時，脫色效果不好，活性炭的吸附能力較差，到達吸附飽和的時間長。而在溫度高時，脫色效果變差，可能是因為發酵液僅經過除菌預處理，液體中含有較多小分子糖類，蛋白質等其它雜質，高溫下易發生反應，產生新的色素。同時，溫度過高，活性炭對多糖的吸附能力也增加，損失率增大。因此選擇脫色溫度為50℃，多糖的脫色效果好，損失率低。

圖3 不同的溫度對活性炭脫色效果的影響Fig.3 Different temperature on the decoloring effect of activated carbon

2.2.4 活性炭脫色pH

如圖4所示，脫色液pH5.5時，活性炭脫色效果最高，pH＞6，脫色率降低，pH在5～7之間多糖的損失率較低。因此，提高脫色效果和降低多糖損失率的前提下，選擇在pH為5.5作為最適活性炭脫色pH值。

圖4 不同pH對活性炭脫色效果的影響Fig.4 Different pH on the decoloring effect of a activated carbon

2.3 吸附樹脂選型

從圖5中可以看出，編號分別為A-E的5種樹脂，對發酵液進一步脫色、去蛋白，樹脂A型相對于其他4種，脫色率最高，能達到96%，C、D、E三種樹脂脫色效果接近，脫色率94%左右，B型脫色率最低。脫完色后計算多糖的損失率，D型的損失率最低，C型損失率最高。對于去蛋白，A、B兩種氮含量較高，C、D、E三種氮含量差距不大。依據能達到良好脫色效果，并且對于多糖的損失降到最低，達到一定去蛋白的效果，通過篩選，D型樹脂能達到較佳的效果。

2.4 超濾

試驗中提取的多糖分子質量在20萬左右，但是經過脫色后的發酵液中，含有大量的單二寡糖等小分子糖類，因此采用超濾手段去除小分子糖類，截留目的產物，提高產品純度，同時也可以起到濃縮的作用。圖6可以看出，超濾第1次，單二寡糖的去除率達到84.8%，繼續超濾，單二寡糖的去除率相比較第1次都很低了，此時去除作用已經不明顯了，但是隨著超濾次數的增大，多糖的損失率逐漸增加。超濾3次，能使單二寡糖的去除率達到96.6%，符合標準，同時降低多糖的損失、節約成本。

圖5 不同類型的樹脂對多糖脫色及蛋白去除的影響Fig.5 Different types of resin decolorization of polysaccharide and protein removal

圖6 超濾次數對去除單二寡糖效果的影響Fig.6 Number of times of ultrafiltration to remove(Mono-di-and oligosaccharides)effect

2.5 干燥方式的選擇

實驗所采用的4種干燥方式特點如下:冷凍干燥，要求很高的真空和低溫，對設備要求高，干燥時間過長，這些因素無形中增加了生產成本，冷凍干燥后的多糖，復溶性好、溶液透亮;滾筒干燥，干燥時間短、可以連續操作、熱效率高，但是干燥完之后得用刮刀將其刮下，干燥后的產品較硬，復溶性較好;噴霧干燥，雖然其生產過程簡化，操作控制方便，但是其所需設備體積較龐大、投資大，同時熱效率很低、能耗大，干燥后的產品復溶性極差;微波干燥，干燥時，能量效率不高，加熱不均勻，局部溫度過高，導致產品顏色不正，表面硬化，復溶性較差。綜合設備、能耗成本考量，對比4種干燥方式，我們選用滾筒干燥方式，其干燥時間短、熱效率高，較其他3種干燥方式干燥效果好、成本低，產品復溶性好。

表2 不同干燥方式對復溶性的影響Table 2 The effect of different drying methods on the complex solubility

2.6 提取后成品質量參數

產品:白色粉末狀、純度 93.31%、黏度 160 mm2/s、水分 3.85%、灰分 1.34%、總氮含量0.045%、單二寡糖1.5%、pH 5.7，提取的成品質量符合國標要求。

3 討論

隨著普魯蘭多糖的使用范圍不斷擴大，提取成本較高、難度較大等現狀，本實驗對發酵液中普魯蘭多糖的提取條件進行了研究，包括除雜時所需硅藻土的型號、用量，脫色過程中活性炭的用量及最適脫色條件，均采用單因素實驗。試驗結果表明，選取一號硅藻土作為助濾劑，用量2%，濾液澄清度高、過濾速度快;脫色活性炭的添加量為0.5%、溫度50℃、時間40 min、pH 5.5，脫色效果好、普魯蘭多糖得率高;樹脂型號D，使得二次脫色效果良好，同時能去除一些雜蛋白;超濾兩次，單二寡糖的去除率能達到96.6%在此條件下，發酵液除雜效果理想、澄清度較高、脫色效果好且普魯蘭多糖得率較高、損失率低;我們選用滾筒干燥方式，其干燥時間短、熱效率高，干燥成本低，干燥后的成品效果好，能達到質量要求。

由于日本對普魯蘭多糖后提取工藝技術的封鎖，對其后提取工藝報道很少，基本上都在實驗室規模。本實驗是在5 t發酵罐規模發酵后，對發酵液中普魯蘭多糖的提取工藝進行研究。在提取過程中，本實驗篩選出一種高性能樹脂，對發酵液進行二次脫色，同時還可以使一些膠體，雜蛋白等雜質與普魯蘭多糖分離，有別于目前普魯蘭多糖的提取工藝，具有一定的創新性。采用膜分離技術，既能夠去除大量的單二寡糖以及一些小分子糖類，也能夠達到一定的濃縮目的，保證了產品的純度及質量。選用區別于傳統噴霧干燥方式的滾筒干燥方法，降低了干燥成本，產品干燥效果好且復溶性更好。普魯蘭多糖的提取方法多采用醇沉法，存在乙醇用量大且重復利用成本高、生產安全性降低、產品帶有乙醇的味道等缺點，本實驗所研究的提取方法不使用乙醇，既降低提取成本，也使得提取過程更加安全。以上一些提取工藝的改進，為以后工業化生產(50 t發酵罐規模)提供數據參考，奠定了一定的基礎。

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