重組畢赤酵母中腺苷甲硫氨酸的純化*

傅夢月，張建國，張繼寧

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093)2(上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海，201403)

腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine，SAM)在生物體中發揮著多種重要的生物功能［1］。而且，SAM處于多種代謝物的代謝途徑的中心位置。實際上SAM分子中每一部分都會轉化為有用的中間代謝物。在臨床上，SAM可以用來治療抑郁癥、骨關節炎、纖維肌痛、老年癡呆癥等［2］。1999年美國食品和藥品監督管理局批準將其作為營養強化劑添加到食品中。在歐洲，SAM在70年代就在市場上銷售了。近年來，有關SAM的生產一直是科研和工業界人員關注的熱點。SAM的生產可以來自化學合成法，以ATP和L-甲硫氨酸為底物的酶促反應，以帶有高活力的腺苷甲硫氨酸合成酶的微生物發酵方法。其中微生物發酵方法由于產量高，成本低，產物中S，SSAM比例高而獲得廣泛認可。很多微生物都被報道用于積累 SAM，例如擬球酵母屬［3］，面包酵母［4］，釀酒酵母［5］，產元假絲酵母［6］，乳酸克魯維酵母［7－8］，大腸桿菌等［9］。經過篩選［10］和突變后［11－12］的微生物菌種發酵所得最高產量為10.08 g/L［4］。用基因工程法重組的釀酒酵母［13］和畢赤酵母［14］也是生產SAM的重要微生物資源。畢赤酵母由于SAM合成酶表達的嚴格控制機制［14］，發酵工藝易于操作，細胞高密度等優點而被廣泛研究［15］。例如，ZHANG從細胞濃度和甲醇的濃度方面入手，以細胞維持能為指標優化SAM的產量［16］。SAM的產量還受到培養液中銨離子濃度［17］，氧載體和輔助碳源［18］的明顯影響。

有關SAM的分離純化工藝的報道并不多。這可能與SAM在中性和堿性條件下不穩定有關。SAM純化工藝的部分階段的研究，例如細胞破碎、SAM的穩定性都有所報道［19－20］。LIU運用有機酸沉淀的方式獲得SAM硫酸鹽的回收率為60%，SAM硫酸和對甲苯磺酸雙鹽的回收率為60%［21］。由于含有微量雜質SAM非常容易吸潮，其純度是純化工藝的重要指標。本研究報道了從重組畢赤酵母中純化SAM的具有較高純度和回收率的完整工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 畢赤酵母和樹脂

重組具有釀酒酵母SAM合成酶基因(Sam2)的畢赤酵母，以醇氧化酶I啟動子表達SAM合成酶。表達質粒pPIC9K的α-信號肽在應用前被切除［18］。大孔樹脂購自上海華震科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵工藝

畢赤酵母在YPD培養基(10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，固體培養基時需要添加20 g/L瓊脂粉)生長后(30℃直到OD600為2～10)，接種到發酵罐(BLBIO-2GL，上海百倫生物科技有限公司)中培養(4%接種量)。發酵罐中含有1.5 L基礎鹽培養基(basic salt medium，BSM)。BSM培養基的組分為 40 g/L 甘油，18.6 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，26.7 mL/L H3PO4，0.93 g/L CaSO4，4.35 mL/L微量元素溶液 (6 g/L CuSO4·5H2O，0.09 g/L KI，3g/L MnSO4·H2O，0.02g/L H3BO3，0.24 g/L MoNa2O4·2H2O，0.5 g/L CoCl2，20 g/L ZnCl2，65 g/L FeSO4·H2O，0.2 g/L 生物素，5.0 mL/L H2SO4)。微量元素在應用前經過直徑為0.22 μm的膜過濾除菌。在發酵過程中，畢赤酵母的培養條件為pH 5.0，500 r/min，30℃。畢赤酵母的發酵過程如下:畢赤酵母首先在BSM培養基中生長16～20 h。接著流加50%甘油(含有12 ml/L微量元素溶液)直到細胞濃度達到110 g DCW/L(干細胞重，約30 h)。然后等待0.5～2 h使畢赤酵母消耗完培養液中的殘余甘油。最后流加甲醇(含有12 mL/L微量元素溶液)誘導畢赤酵母高效表達SAM合成酶［16］。在流加甲醇誘導2 h后加入10 g/L甲硫氨酸使畢赤酵母細胞積累SAM。

1.2.2 細胞破碎

離心(6 000 r/min，3 min)收集細胞后，以去離子水洗滌細胞2次。本研究中采用3種方法破碎細胞:1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L高氯酸在4℃下混合2 h;1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸(1 mol/L)在4℃下混合2 h;1.0 kg濕細胞與4 L 1 mol/L硫酸在4℃下混合2 h。然后離心收集上清(6 000 r/min，10 min)。發酵液和等體積20%高氯酸混勻后冷卻至4℃，放置8 h以上，離心(12 000 r/min)3 min，經0.22 μm膜過濾，上清液中SAM含量作為細胞中絕對SAM含量。

1.2.3 樹脂的靜態篩選

首先，10 g大孔樹脂(表1)與50 mL SAM溶液在100 r/min，0℃混合吸附SAM。利用過濾的方式回收樹脂。樹脂與50 mL 1mol/L硫酸在100 r/min，0℃下解析SAM。操作期間提取SAM溶液，測定吸附和解析的效果。

表1 本研究中采用的4種樹脂Table 1 Four types of resin used in this study

1.2.4 靜態條件下SAM濃度與pH對吸附的影響

10 g D151分別與50 mL質量濃度為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L 的 SAM 溶液在100 r/min，0 ℃混合2 h。利用氨水調節pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。SAM 吸附率計算:

式中，C0:初始 SAM質量濃度，g/L;C:吸附后SAM質量濃度，g/L。

1.2.5 靜態條件下硫酸溶液濃度對SAM解吸的影響

吸附SAM后的10 g D151樹脂經過分離后在pH4.5，100 r/min下分別與 50 mL 濃度為 5、10、20、50、100、200、500、1 000 mmol/L 的硫酸溶液混合1 h。

1.2.6 SAM溶液的流速對SAM吸附的影響以及硫酸對SAM解吸的影響

SAM 溶液 (7.71 g/L，pH 4.5)分別以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min的流速流過D151柱 (8 cm×2 cm)。然后以2倍柱體積去離子水洗滌。用0.1 mol/L的硫酸分別以 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min洗脫。每 5 min收集洗脫液進行分析。

1.2.7 SAM分析

采用高效液相色譜法(Waters 1525，2487，Milford，United States)。SAM樣品經過直徑為0.22 μm的膜過濾后進行分析。液相色譜柱為Hypersail SCX column(4.6mm ×250 mm，5 μm)。流動相為 0.5 mol/L甲酸銨溶液(pH4.0)。

2 結果和分析

2.1 不同細胞破碎方法對SAM釋放的影響

本研究參考了文獻中機械沖壓、超聲等方法后采用化學溶劑法破碎細胞。這是由于化學法破碎細胞成本低，容易放大操作規模。在1 mol/L高氯酸、1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸、1 mol/L硫酸破碎溶液中 SAM的釋放率分別為 96.22%、94.02%、75.00%(表2)。相比硫酸，高氯酸屬于強氧化劑，考慮到化學溶劑對環境的危害，所以盡量減少高氯酸的使用。在1 mol/L硫酸中SAM的釋放量較低(75.00%)，所以1 mol/L乙酸乙酯和1 mol/L硫酸的混合溶液作為破碎細胞的溶液。在乙酸乙酯和硫酸的混合溶液破碎細胞過程過程中，乙酸乙酯可以溶解細胞壁的脂層導致細胞的破碎，硫酸可以將細胞膜水解完全，最后導致較高的破碎率。而且SAM在酸性環境下比較穩定。

表2 不同化學試劑破碎細胞的SAM釋放率Table 2 SAM released ratios by different chemicals

2.2 樹脂的靜態篩選

圖1是50 mL 7.71 g/L SAM溶液分別與4種樹脂混合時溶液中SAM濃度的變化。4種不同樹脂都可以很好地吸附SAM，最后溶液中SAM濃度都降低為0.5 g/L。但是SAM濃度的降低速率從快到慢依次為JK110、D151、HD-1、DK110。強酸性樹脂(JK110)比弱酸性樹脂(DK110)對SAM的吸附速度快。DK110需要60 min達到SAM濃度的吸附平衡。而其他3種樹脂需要30～35 min達到吸附平衡。D151與JK110具有相似的吸附曲線，說明具有相似的吸附能力。

圖1 靜態條件下不同樹脂對SAM的吸附曲線Fig.1 SAM absorption by different resins at different times

利用1 mol/L硫酸分別洗脫4種吸附SAM后的樹脂的結果見圖2。JK110釋放SAM的速度最慢。HD-1釋放SAM的速率比較穩定，比DK110和D151慢。DK110和D151釋放SAM的速率相近。結合圖1，D151對SAM的交換容量最大，所以本研究中選擇D151作為分析SAM的樹脂材料。

圖2 靜態條件下硫酸溶液洗脫不同樹脂上SAM的曲線Fig.2 SAM deabsorption from different resins in sulfuric acid solution

2.3 SAM質量濃度和pH對D151吸附SAM的影響

SAM溶液的質量濃度由5.00 g/L提高到15.00 g/L，D151對SAM的吸附量也逐漸增加 (表3)。可是，SAM的吸附率由95.00%降低到55.73%。考慮到初始SAM的濃度和吸附率，本研究中采用SAM溶液的質量濃度為7.50 g/L。

表3 SAM濃度對D151吸附SAM的影響Table 3 Effects of SAM concentrations on SAM absorption to D151

由于SAM分子上具有豐富的離子基團(圖3)，選用離子交換法是分離SAM的主要手段。SAM分子中腺苷上氨基的等電點為pH3.4，核糖上羥基的等電點為pH12.5，L-甲硫氨酸上氨基和羧基的等電點分別為pH7.8和pH1.8。可見，在任何pH值下SAM分子都有基團處于離子化的狀態。由于SAM在堿性環境中不穩定，所以SAM的純化過程要保持酸性環境。由于D151是弱酸性陽離子交換樹脂(表1)，SAM的吸附量和吸附率在pH由2.5升高為6.5時也升高(表 4)。SAM吸附率由14.94% 提高到96.23%。SAM吸附率在pH4.5時為92.95%。pH繼續升高時SAM吸附率升高不明顯。D151在pH4.5吸附SAM量為36.95 mg SAM/g樹脂。

圖3 SAM的分子結構Fig.3 Molecular structure of SAM

表4 pH對D151吸附SAM的影響Table 4 Effect of pH on SAM absorption to D151

2.4 硫酸濃度對SAM洗脫的影響

硫酸溶液作為洗脫液在濃度升高時，SAM的洗脫率逐漸升高(圖4)。圖4中SAM的洗脫率可以分為3個階段:硫酸濃度在20 mmol/L以下，SAM的洗脫率升高緩慢;硫酸濃度在20 mmol/L和100 mmol/L之間SAM的洗脫率快速升高;硫酸濃度高于100 mmol/L后SAM的洗脫率升高平緩。

圖4 不同濃度硫酸對洗脫SAM的影響Fig.4 SAM released ratio from D151 by different sulfuric acid concentrations

2.5 SAM溶液的流速對SAM吸附的影響

SAM溶液的流速對D151吸附SAM的結果見圖5。本研究以吸附90%作為基本要求。在SAM溶液流速分別為 0.1、0.2、0.5、1.0 mL/min 時 D151 吸附90%SAM 所需要的時間分別為 1150、360、200、70 min。本研究采用0.2 mL/min流速的SAM溶液，吸附率為92.00%。

圖5 SAM溶液的流速對D151吸附SAM的影響Fig.5 Effect of SAM solution flow rate on SAM absorption to D151

2.6 硫酸溶液的洗滌流速對洗脫SAM的影響

表5是硫酸溶液洗脫的流速對SAM洗脫的影響。SAM的洗脫率隨著硫酸溶液的流速逐漸增加而先升高而后降低。在硫酸溶液的流速為0.2 mL/min時SAM的洗脫率為最高(92.52%)。SAM的溶液經過高效液相色譜測定后純度為92%(圖6)。

3 結論

本研究報道了一個完整的SAM的純化工藝的優化過程。在這個純化工藝中，首先采用化學試劑法破碎細胞得到94.02%的SAM釋放率。然后經過離子交換樹脂純化SAM(92.00%吸附率，92.52%洗脫率)的純度為92%。本工藝中SAM的最終回收率達到80.03%。

圖6 分離后SAM溶液的高效液相色譜分析圖Fig.6 SAM analysis by HPLC

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