Bacillus mucilaginosus SM-01補料分批發酵產胞外多糖*

楊慶勝，閆玉潔，馬洋，李會，史勁松

(江南大學藥學院，江蘇無錫，214122)

微生物多糖是由微生物細胞合成的一種糖類高分子聚合物，可分為胞內多糖、胞外多糖和結合多糖3種。胞外多糖具有純度高、產量大、提取簡便等優點，其應用也最為廣泛，目前在食品、日化、制藥和廢水處理等多個行業有著廣泛的應用［1］。

膠質芽孢桿菌最早由 Passik首次分離［2］，其在特定的生長狀態下能夠合成大量莢膜多糖［3］，這種多糖的生成與膠質芽孢桿菌的解磷、解鉀、礦化脫硅等功能密切相關［4－6］。提取后的胞外多糖還可作為生物絮凝劑、陶瓷行業的添加劑等［7］。此外，還有研究表明，膠質芽孢桿菌胞外多糖有顯著改善免疫力作用，作為高分子組織材料有著良好的開發前景［8］。

通過深層發酵培養可以大量獲取膠質芽孢桿菌胞外多糖，目前在優化的工藝條件下，可以達到24 g/L的產量［9］。培養基中的碳源，不僅作為菌體生長的營養物質，而且是多糖碳架的前體物質，提供充足的、容易代謝和利用的碳源，是合成大量胞外多糖的必要條件。而一次性在培養基中添加大量碳源，會導致菌體生長受到抑制，并影響體系的傳質和溶氧，使多糖產量顯著下降［10］。通過補料分批發酵工藝可在一定程度上避免底物抑制，提高多糖產量和糖質轉化效率［11］，但需要對初始糖濃度、補料時間進行選擇，使多糖的發酵產率和碳源轉化效率趨于優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑

菌株Bacillus mucilaginosus SM-01，保藏于中國菌種保藏中心(CGMCC5766);HCl、無水乙醇、葡萄糖、尿素、CaCO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O 及 NaCl等試劑均為國產分析純。

1.1.2 培養基

(1)斜面培養基(g/L):蔗糖 10.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，尿素 0.1，CaCO35.0，瓊脂 20，pH 7.0 ～7.2。

(2)種子培養基(g/L):蔗糖 10.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，尿素 0.1，CaCO35.0，pH 7.0 ～7.2。

(3)發酵培養基(g/L):葡萄糖60.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.6，NaCl 0.4，尿素 0.3，CaCO35.0，pH 7.0 ～7.2。

1.2 實驗儀器

722型分光光度計，尤尼可上海儀器有限公司;CR22GⅡ冷凍高速離心機，日本日立公司;SPX-250型生化培養箱，上海躍進醫療器械廠;生物傳感分析儀SBA-40D，山東省科學院生物研究所;5 L發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質芽孢桿菌的培養

種子培養:將斜面菌種劃線于平板，30℃活化培養24 h，再用接種環挑取2環已活化的菌種轉接到種子培養基中，30℃、150 r/min培養24 h。

搖瓶發酵培養:將種子液4 mL接入裝有100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，30℃、150 r/min培養。

5 L發酵罐培養:將120 mL種子液接入5 L發酵罐，裝液量3.0 L，培養溫度30℃，通氣量6 L/min，攪拌轉速500 r/min。

1.3.2 測定方法

菌體濃度測定:取1 mL發酵液，加入等體積2%HCl，混勻，再稀釋5倍，于600 nm測定吸光值(OD)。

葡萄糖濃度測定:取1 mL發酵液，稀釋100倍，然后12 000 r/min離心5min，取上清液，用生物傳感分析儀測定。

粗多糖濃度測定:取1 mL發酵液，稀釋10倍后，12 000 r/min離心20 min，取上清液，加入3倍體積無水乙醇，混勻，4℃沉淀10 h。8 000 r/min離心10 min，棄上清液得粗多糖。將粗多糖真空干燥至恒重，以分析天平稱重。

2 結果與分析

2.1 初始葡萄糖濃度對菌體生長及產糖的影響

為選擇發酵培養基適宜的初始葡萄糖濃度，分別考察葡萄糖質量濃度為 10，20，30，40，50，60，70 g/L時膠質芽孢桿菌的生長和產糖情況(圖1)。

圖1 不同初始葡萄糖濃度對菌體生長和多糖濃度的影響Fig.1 Effects of different initial glucose concentration on cell growth and polysaccharide concentration

結果表明，初始葡萄糖濃度為10 g/L時，菌體濃度(OD600)最高，為4.41，而初始葡萄糖濃度為60 g/L時，胞外多糖濃度最高，為28.11 g/L，可見菌體生長和胞外多糖合成所需葡萄糖最適濃度并不相同。當初糖濃度為30 g/L或更高時，菌體生長明顯變差，且葡萄糖轉化效率降低。綜合考慮多糖濃度葡萄糖轉化率及菌體生長情況，以初始葡萄糖濃度為60 g/L效果較好，此時菌體生長情況及葡萄糖轉化率并非最優，但多糖濃度達到最高，故選擇60 g/L作為下一步補料分批發酵的最優初始葡萄糖濃度。

從提高葡萄糖轉化率角度分析，較低的或較高的初始葡萄糖濃度均不適宜，20～40 g/L是較為合適的濃度。為進一步比較不同初始葡萄糖濃度下的菌體生長速率、多糖合成速率，為補糖策略提供依據，實驗詳細測定了20，30，40 g/L三種濃度下的菌體濃度、多糖濃度的過程數據，通過不同批次的比生長速率、多糖比合成速率進行比較，發現在3種濃度下，盡管初始比生長速率有所差異，但在12 h后基本接近(圖2)。不同初始葡萄糖濃度對多糖比合成速率影響較大(圖3)，當初糖濃度為30 g/L，發酵前36 h產物比合成速率較高，之后，可能由于體系中糖濃度的降低(36 h時殘存葡萄糖濃度為11 g/L，60 h耗盡)，使產物合成速率開始降低。因此，要使產物合成速率保持較高的水平，需要向體系進行糖質補充。

圖2 初始葡萄糖濃度對菌體比生長速率的影響Fig.2 Effects of different initial glucose concentration on specific cell growth rate

圖3 初始葡萄糖濃度對產物比合成速率的影響Fig.3 Effects of different initial glucose concentration on specific polysaccharide formation rate

2.2 補糖策略確定

胞外多糖合成需要大量碳源，但其濃度較高則會抑制多糖合成。微生物胞外多糖合成會受到高濃度速效碳源阻遏［12－13］，通過補料來控制其濃度即可解除這種阻遏。微生物胞外多糖合成一般分兩個階段:前期菌體繁殖階段及后期多糖積累階段。發酵前期可控制碳源濃度處于合適的水平使菌體得以生長良好，發酵后期補充碳源可為多糖合成提供充足基質。根據前面的初步研究，基本確定30 g/L作為初始葡萄糖濃度，以36 h作為流加補糖的操作時間點。在此基礎上，研究了3種補料方式對菌體生長及多糖合成的影響(表1)。一次性補料工藝:在發酵進行36 h時，一次性將30 g/L的葡萄糖補加進發酵罐;恒速流加補料工藝:在發酵進行36 h，以0.83 g/(L·h)恒定速度將30 g/L葡萄糖補加進發酵罐，至72 h補加完畢;分批補料工藝:于36、48、60及72 h分批次補加葡萄糖，每次補加葡萄糖量為7.5 g/L。

表1 不同補料方式對菌體生長及多糖合成的影響Table 1 Effects of different feeding methods on cell growth and polysaccharide yield

結果表明，采取分批補糖發酵方式能達到最好的效果，而且比恒速流加補料工藝操作簡便。其發酵工藝可以概述為:在發酵初期以30 g/L葡萄糖作為初始碳源，發酵進行36 h開始補料，以后每隔12 h補1次，共補加4次，每次補加7.5 g/L葡萄糖，全部發酵過程總葡萄糖濃度為60 g/L。

2.3 5 L發酵罐中分批發酵與補料分批發酵結果比較

以2.2中確定的補糖策略，在5 L發酵罐中進行補料發酵實驗，并與分批發酵結果相對比，以此驗證2.2中確定的補糖策略的合理性。補料分批發酵:初始葡萄糖濃度為30 g/L，發酵進行36 h開始補料，之后每隔12 h補1次，共補加4次，每次補加7.5 g/L葡萄糖，全部發酵過程總葡萄糖濃度為60 g/L。分批發酵:初始葡萄糖濃度為60 g/L，發酵過程中不進行任何形式的葡萄糖補加。發酵罐其他條件相同，如1.3.1。

比較分批發酵和補料發酵的過程(圖4)，可看出分批發酵過程前期菌體生長較補料分批發酵慢，發酵72 h左右進入穩定期后，分批發酵菌體濃度明顯低于補料分批發酵工藝，多糖濃度僅為28.22 g/L，葡萄糖轉化率為47.0%，轉化率較低。究其原因，可能是由于分批發酵過程多糖過早合成并積累，導致發酵體系中傳氧、傳質效果不佳，不利于菌體生長;發酵進行60 h，發酵體系中仍殘存較高濃度葡萄糖，并且之后葡萄糖利用速度明顯變慢，引起抑制效應，進一步限制多糖積累。在其他微生物多糖，如結冷膠的發酵過程中也有類似現象［14］。

圖4 發酵罐中分批發酵與補料分批發酵過程圖Fig.4 Batch and fed-batch fermentation process changes in fermentation

補料分批發酵前期菌體生長較快，60 h左右便進入穩定期，說明發酵前期降低初始葡萄糖濃度有利于菌體生長。發酵前期多糖積累較慢，遲滯期約10 h，20 h左右多糖開始積累，較分批發酵遲。36 h補加葡萄糖后，多糖繼續大量積累。多糖濃度最終達到38.62 g/L，葡萄糖轉化率為64.4%，相對于分批發酵提高36.8%。由此可見，補料分批發酵工藝對菌體生長、產物合成及葡萄糖轉化率等均具有促進作用，且對提高多糖產量效果尤為明顯。

3 結論

本研究在考察Bacillus mucilaginosus SM-01對葡萄糖利用效率和胞外多糖合成產量的基礎上，通過比速率分析，確定了合適的初始葡萄糖濃度和補料時間，進而通過不同補料工藝的對比研究，確定了分批補料的發酵策略。在5 L發酵罐上，通過補料分批發酵，膠質芽孢桿菌胞外多糖濃度達到38.62 g/L，相對分批發酵提高了36.8%，葡萄糖轉化率也由47.0%提高至64.4%。

國內外基于發酵罐，關于膠質芽孢桿菌胞外多糖發酵工藝的報道還較少，本文對膠質芽孢桿菌胞外多糖發酵工藝進行研究并提出一套高產的補料工藝，對促進膠質芽孢桿菌胞外多糖的大規模應用有重要意義。本文以提高膠質芽孢桿菌胞外多糖發酵產率及葡萄糖轉化率為目標，立足于初始葡萄糖濃度、補料時間及補料方式對發酵過程的影響，提出了一種補料分批發酵的工藝，提高了膠質芽孢桿菌胞外多糖的發酵產率及葡萄糖轉化率。該工藝簡便，具有較好的工業可操作性，對降低膠質芽孢桿菌胞外多糖的工業成本、提高產品經濟效益有積極意義。

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