高產蝦青素的雨生紅球藻脅迫條件和中試研究*

廖興輝，王明茲，2，3，李小妹，黃鍵，2，3，傅燕秋，陳必鏈，2，3，鄭行

1(福建師范大學生命科學學院，福建福州，350117)2(福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心，福建福州，350117)3(福建省現代發酵技術工程研究中心，福建 福州，350117)4(福清市新大澤螺旋藻有限公司，福建福清，350300)

蝦青素由于具有超強的抗氧化能力和出色的著色能力，被廣泛地運用到水產養殖業、化妝品行業、健康食品行業和制藥行業［1－4］。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種常見的生存于淡水中的單細胞綠藻，生長周期中明顯地呈現出2個階段:在生長條件適宜的情況下，以綠色帶鞭毛的可游動細胞形態大量繁殖;在生長環境不利的情況下，綠色游動細胞逐漸喪失鞭毛，細胞壁加厚，形成紅色包囊，同時細胞質油脂小泡中大量積累蝦青素。在不利條件下積累蝦青素的含量可高達干重的5%［5］，并且具有所需營養簡單的特點，因此被認為是生產蝦青素最好的自然資源。

然而與螺旋藻、小球藻等已工業化生產的微藻相比，雨生紅球藻由于生長緩慢、生長溫度較低、易受污染等原因使得大規模高密度培養受到限制［6－7］，同時這也是如何利用雨生紅球藻實現蝦青素高產的研發熱點與難點。國外有少數幾家企業能夠商業化培養雨生紅球藻，但它們對技術實行了嚴格的保密，形成壟斷［8］。國內也有不少的研究者對雨生紅球藻進行了研究，但所得到的蝦青素含量和生物量都比較低［9－15］。

本文對1株高產蝦青素的雨生紅球藻脅迫培養條件進行研究，在此基礎上，于2013年8月～2014年1月到位于四川省米易縣的宇昌微藻有限公司采用平板式光照生物反應器進行中試實驗，以期為該雨生紅球藻的大規模培養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藻種

實驗用雨生紅球藻藻種保存于本研究室。

1.2 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

500 mL三角瓶裝200 mL培養液，培養基為BG11，培養溫度(25±2)℃，日光燈提供光照，光強900～1 100 Lux，每天振搖3次，培養14 d。將細胞濃度調整至2.5×105個/mL的藻液作為接種液，按接種液和新鮮培養基的體積之比1∶4，將接種液接種至各脅迫培養基中，每個處理設3個重復。

氮、磷饑餓對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，采用含原培養基1/10、1/5和不含氮、磷的BG11培養基，培養溫度(25±2)℃，每天搖3次，在光照強度4 000～6 000 Lux下連續脅迫培養11 d，以完整的BG11培養基培養作為對照。

進行鹽濃度脅迫時，采用含NaCl質量濃度為4、6和8 g/L的BG11培養基，以不含NaCl的基本BG11培養基作為對照，其余條件與氮、磷饑餓時相同。

光照強度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，采用4 000～6 000 Lux(I1)、6 000 ～8 000 Lux(I2)、8 000 ～10 000 Lux(I3)3個范圍的光照，使用基本的BG11培養基與完全缺氮培養基培養，其余條件與氮、磷饑餓時相同。

裝液量對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，用500 mL三角瓶作為培養容器，使用基本BG11在4 000～6 000 Lux光照強度下培養，完全缺氮和缺磷培養基在6 000～8 000 Lux光照強度下培養，設置接種后總體積分別為100、150、200 mL三個實驗組，其余條件與氮、磷饑餓對雨生紅球藻積累蝦青素的影響相同。

1.3 平板式光照生物反應器培養雨生紅球藻

利用自行構建的平板式光照生物反應器培養雨生紅球藻，反應器由支架框、PE材質透明袋、曝氣系統、取樣管四部分構成。在營養細胞培養階段采用長1 m、寬0.1 m、高1 m的平板式生物反應器，使用BG11培養基，培養液體積為40 L，以8 L/min的通氣量通入空氣，光強為4 000～5 000 Lux，每日取樣測量生物量。在脅迫階段采用長1 m、寬0.06 m、高1 m的平板式光照生物反應器，使用缺氮的BG11培養基，培養液體積為50 L。每天10∶30～16∶30于室外通過增減表面遮蓋的透光性良好的PE薄膜袋數量來控制光強，利用增大表面通風量的方法控制溫度不超過27℃。每天16∶30至次日10∶30將反應器搬至恒溫室內［(25±2)℃］，由日光燈從兩側提供光照，光強為8 000～10 000 Lux，以10 L/min的通氣量通入空氣，每隔48 h取樣測量生物量及蝦青素含量。

1.4 生長指標測定

1.4.1 細胞計數

按照金傳蔭等的方法，用“浮游生物計數框”進行細胞計數［9］。

1.4.2 細胞干重的測定

取30 mL 藻液，8 000 r/min，4 ℃，離心 15 min，去上清液，蒸餾水洗滌1次，置于70℃烘箱內烘至恒重，冷卻后稱重。

1.4.3 蝦青素含量與濃度的測定

參照Boussiba等的方法，使用DMSO作為萃取劑，測量藻細胞中蝦青素的含量與培養液中蝦青素濃度［16］。

1.4.4 生產率的測定

生產率［g/(L·d)］計算:

其中DWt和DW0分別指培養t天和起始生物量干重，g/L;t指培養時間，d。

2 結果與討論

2.1 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

促進雨生紅球藻積累蝦青素的方法中，營養饑餓處理和高光處理較為容易實現且效果明顯。不同脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響見圖1。

從圖1－A中可以看出，蝦青素濃度隨著培養基中氮含量的下降而上升，在不含氮的培養條件下，蝦青素濃度可達到(13.92±0.24)mg/L。缺氮之所以能夠引起雨生紅球藻積累蝦青素，董慶霖等認為是由于培養基中氮濃度下降到一定程度時會抑制1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和硝酸還原酶的活性，當兩種酶的活性下降到一定水平時會引發雨生紅球藻積累蝦青素［10］;同時缺氮情況下1，5-二磷酸核酮糖羧化酶作為氮庫為蝦青素的積累提供氮源［11］。同氮饑餓處理一樣蝦青素濃度隨著培養基中磷含量的下降而上升，在不含磷的培養條件下，蝦青素濃度可達到(17.52±1.43)mg/L(見圖1－B)。缺磷有助于雨生紅球藻從游動細胞轉向不動包囊體細胞，同時有效地刺激蝦青素的合成［17］。

從圖1－C中可以看出，蝦青素濃度先隨著NaCl濃度的增加而增加，但NaCl濃度超過6 g/L時，隨著NaCl濃度的增加會引起蝦青素含量的下降。這是由于NaCl在較低濃度時可以在不損壞藻細胞的情況下促進蝦青素的積累，而當NaCl濃度過高時，藻體細胞會完全失去繁殖能力甚至裂解死亡［18］。最適合該藻積累蝦青素的NaCl質量濃度為6 g/L，蝦青素質量濃度達(13.86±0.83)mg/L。

從圖1－D中可以看到，高光強對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，在基本培養基中，蝦青素濃度在光強4 000～6 000 Lux和光強6 000～8 000 Lux的培養條件下無明顯區別，分別為(8.32±0.12)mg/L和(8.02±0.37)mg/L。而在缺氮培養基中，6 000～8 000 Lux光強的培養條件下的蝦青素濃度為(22.98±0.11)mg/L，比4 000～6 000 Lux光強的培養條件下高出66.34%。無論是在基本培養基或缺氮培養基，光強超過8 000 Lux時蝦青素濃度會出現明顯的下降。這是因為光強過高時會損害藻體細胞積累蝦青素的能力，并引起細胞死亡［19］。才金玲等單獨使用高光脅迫培養雨生紅球藻，最終得到的蝦青素含量為 0.62%(干重比)，生物量為 0.44 g/L［12］;莊惠如等結合氮饑餓和高光脅迫培養，得到的蝦青素含量為6.34 mg/L［13］。本實驗在光強 6 000 ～8 000 Lux、缺氮、培養液體積為100 mL/500 mL三角瓶的條件下得到的蝦青素含量和生物量都比上述的實驗結果高，但低于Boussiba等使用缺氮或缺磷結合高光處理的方法，得到蝦青素含量超過100 mg/L的實驗結果［20］，以及Kang等人采用高光、缺氮、通入含5%CO2的空氣、培養液體積為130 mL(500 mL三角瓶)培養時得到的蝦青素含量大于7%，生物量為2.28 g/L的實驗結果［21］。

圖1 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響Fig.1 Effects of stress induced conditions on the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

裝液體積的變化會影響光徑和培養液中氣體的交換，進而影響藻體細胞的生長和蝦青素的積累。從圖1－E可以看到，無論是在基本培養基還是缺氮、缺磷培養基中，蝦青素的濃度都隨著培養體積的增加而下降，培養液體積為100 mL時最適合該藻積累蝦青素，配合缺氮、6 000～8 000 Lux光強脅迫培養時，蝦青素濃度為(59.23±2.13)mg/L，可達藻細胞干重的(4.20±0.19)%。

在綜合各單因子實驗得出的條件下脅迫培養雨生紅球藻12 d，蝦青素的積累情況如圖1－F所示，雨生紅球藻中的蝦青素含量在前10天都在增加，第10天達到最高水平為(4.16±0.25)%;而生物量一直都在增加，到第12天達到(1.1±0.02)g/L，蝦青素質量濃度最終為(44.58±2.68)mg/L。

2.2 平板式光照生物反應器中雨生紅球藻的生長情況

實驗于(25±2)℃恒溫室內進行。從圖2可以看到，在平板式反應器中，當接種濃度為OD681=0.24時，雨生紅球藻生長過程未有明顯的生長延滯期，接種后進入對數生長階段直到12 d，期間生產率為0.048 5 g/(L·d)，第13天后進入平穩期，大部分細胞轉變為不動孢子，最終生物量可達到0.88 g/L。當接種濃度為OD681=0.14時，前3天為生長延滯期，從第4天到第8天為對數生長時期，而后進入平穩期。這主要是由于接種濃度較高時，可使藻細胞較快地適應新的培養環境。

采用半室外條件下平板式反應器培養雨生紅球藻，實驗于與外界氣溫相同，但無陽光直射的房間內進行，光照主要由自然光提供，附加日光燈，確保光強度為4 000 ～5 000 Lux，每日最低溫度于4∶00 ～5∶00測得，最高溫度于14∶00～15∶00測得。由于溫度的變化，雨生紅球藻的生長情況與在室內恒溫條件下有所不同。從表1中可以看出在半室外條件下，當接種濃度為OD681=0.24，藻細胞經過1天的適應后開始快速生長直至第13天，前13天的生產率為0.057 1 g/(L·d)，14 d后進入生長穩定期，藻細胞大部分轉變為不動孢子，最終生物量為1.04 g/L。

圖2 室內平板式光生物反應器中雨生紅球藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of Haematococcus pluvialis in indoor flat-photobioreactor

表1 半室外平板式光照生物反應器中雨生紅球藻的生長Table 1 The growth of Haematococcus pluvialis in flatphotobioreactor in semi-outdoor process

在半室外培養雨生紅球藻綠色細胞時，在接種濃度較低時(OD681=0.14)，幾乎無法生長。

2.3 平板式光照生物反應器中雨生紅球藻積累蝦青素情況

由于室外晝夜溫差較大且室內光強無法脅迫平板式光照生物反應器內的藻細胞變紅，因此采取半室外的脅迫培養方式，實驗結果見表2和圖3。

表2 半室外脅迫培養過程中雨生紅球藻積累蝦青素Table 2 Astaxanthin accumulated in Haematococcus pluvialis in stress induced process and semi-outdoor condition

圖3 半室外脅迫培養過程中雨生紅球藻生物量和蝦青素生產率的變化Fig.3 The biomass and astaxanthin productivities of Haematococcus pluvialis in stress induced process and semi-outdoor condition

從表2可看到在脅迫起始階段(開始2 d)蝦青素的含量會有所下降，這是由于在脅迫起始階段的光強偏弱，且培養液中的氮源仍未消耗完全，導致藻細胞仍可以分裂繁殖;而后隨著光強的提高，藻細胞繁殖受到抑制，細胞轉變為包囊狀態開始較快地積累蝦青素，培養16 d，蝦青素生產率為1.05 mg/(L·d)，最終蝦青素濃度可達到17.49 mg/L，生物量為1.17 g/L。

在半室外脅迫變紅過程中，生物量的生產率先隨著光強的增加而提高，在第6天時達到最大值0.086 g/(L·d)，而后隨著光強的增加而下降。這主要是由于在脅迫培養前期光照較弱，部分藻細胞仍能分裂繁殖，隨著光照強度的提高，藻細胞受到的脅迫壓力逐漸增大，細胞繁殖功能受影響，造成生物量增加但產率下降。蝦青素生產率由藻體生物量和藻細胞中的蝦青素含量共同決定，因此蝦青素生產率的變化和生物量的不同。脅迫培養前6天，由于生物量和藻細胞中蝦青素含量的快速增加，蝦青素生產率快速提高，從第6到第8天雖然藻生物量的增加幅度變小，但藻細胞中蝦青素的積累仍十分迅速，致使此時間段蝦青素生產率仍快速增長。第8天后由于藻生物量增長速度和藻細胞中蝦青素積累速度放緩，造成蝦青素生產率下降，而后進入緩慢增長階段(見圖3)。

李曉夢等利用混養培養的方法在室外實現了雨生紅球藻的擴大培養，其放大規模(10 L)下所得到的藻粉產量(0.20 g/L)和蝦青素含量(0.86%)均低于本實驗的結果［14］;沈淵等在室內利用氣升式光生物反應器培養雨生紅球藻取得了單位體積蝦青素產量和本實驗相當的結果(18 mg/L)，但擴大規模僅為20 L，且反應器結構復雜、造價昂貴(NHL-Ⅲ型光生物反應器)［15］;WANG等利用氣升式光生物反應器培養雨生紅球藻，在室外擴大培養中得到了高達160 mg/L的蝦青素濃度，但放大規模僅為0.6 L［22］;劉偉等利用生物幕技術成功地進行了雨生紅球藻的規模化培養，培養體積在營養階段達到40 t，但脅迫變紅的生物幕技術使用固定化培養，造成生物量低［23］。

3 結論

脅迫條件探究實驗表明，完全缺氮有利于雨生紅球藻積累蝦青素，蝦青素產量可達到(13.92±0.24)mg/L。完全缺磷有利于雨生紅球藻積累蝦青素，蝦青素產量可達到(17.52±1.43)mg/L。NaCl脅迫培養時，藻細胞中蝦青素的含量隨著NaCl濃度的增加而升高，但濃度過高時會對藻細胞的生長產生抑制，甚至引起藻體的裂解死亡，最適合此藻積累蝦青素的氯化鈉濃度為6 g/L，蝦青素產量可達到(13.86±0.83)mg/L。光強在較低水平時可以提高蝦青素在藻細胞中的含量，當光強超過8 000 Lux時不僅會抑制藻細胞的生長還會損害其積累蝦青素的能力，適合此藻積累蝦青素的光強為6 000～8 000 Lux，在缺氮情況下可獲得(22.98±0.11)mg/L的蝦青素產量。培養液體積的改變可通過改變光徑和氣體的交換影蝦青素在藻中的積累，100 mL的裝液體積培養時蝦青素濃度可到達(20.29±1.01)mg/L。綜合上述各因子最優條件脅迫培養時，蝦青素濃度為(44.58±2.68)mg/L。

利用平板式光照生物反應器進行中試試驗。在綠色細胞培養階段，使用平板式光照生物反應器在室內和半室外培養時，培養液中的生物量可達到0.88 g/L與1.04 g/L，在進入穩定期前生產率分別為0.048 5 g/(L·d)和0.057 1 g/(L·d);在脅迫變紅階段，使用平板式光照生物反應器在半室外的培養條件下生物量可達到1.17 g/L，藻細胞中蝦青素含量為1.49%，單位體積蝦青素產量為17.49 mg/L，蝦青素生產率為1.05 mg/(L·d)。

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