不同分子質量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的制備和化學組成分析*

鐘思燕，王維民，諶素華，蔡璐

(廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江，524088)

巖藻聚糖硫酸酯是存在于褐藻中以L-巖藻糖為主，多種單糖殘基以及硫酸基組成的水溶性雜多糖，具有廣泛的生物活性，如抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓、降血脂等［1］。其分子質量分布廣，從幾萬到幾十萬不等，多糖生物活性與其分子質量和化學組成有密切關系，但是大分子質量巖藻聚糖硫酸酯溶解性低，生物利用性不好，在很大程度上限制其生物活性的應用。近年來，許多研究表明低分子質量巖藻聚糖具有更好的溶解性、吸收性、生物利用率，及良好的生物活性［2－5］，因此研究巖藻聚糖降解條件是馬尾藻巖藻聚糖及其產品開發和應用亟待解決的問題。多糖的降解方法大致分為物理法、化學法和生物法，其中化學法主要包括酸降解法和過氧化氫降解法，而酸降解法的優點是工藝簡單，產品質量易于控制，利于實現工業化生產，雖會產生一定的脫硫作用，但溫和的條件仍可得到活性較好的低分子質量巖藻聚糖硫酸酯。

本研究以圍氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品為研究對象，通過控制酸水解條件分別降解2種硫酸基含量不同的大分子巖藻聚糖硫酸酯并對其進行純化，獲得 MMWF1、LMWF1、MMWF2和LMWF2四個組分，對4組分的化學組成進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

圍氏馬尾藻(Sargassum fucoidan)，采于廣東湛江硇洲島，經沖洗、曬干、粉碎、過80目篩，干燥保存備用。用超聲波浸提工藝提取后得到實驗材料馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品［6］。

1.2 主要試劑

濃H2SO4、乙酸酐等，均為國產分析純;標準分子質量葡聚糖、L-巖藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖等試劑，均為進口色譜純;DEAE-52纖維素，廣州鼎國生物技術有限公司;Sephacryl S-200HR，美國GE公司。

1.3 儀器設備

中低壓半制備色譜儀，日本埃朗科技;高速冷凍離心機，日本日立;紅外光譜儀，美國Nicolet;氣相色譜儀，上海天美科學儀器;真空冷凍干燥機，韓國ilshin。

1.4 實驗方法

1.4.1 DEAE-52纖維素離子交換層析法初步分級巖藻聚糖硫酸酯粗品

稱取150 mg馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品，用水稀釋后上樣，依次用蒸餾水、1、2和3 mol/L NaCl作洗脫液逐級洗脫，流速為1 mL/min，每管收集5 mL。用苯酚-硫酸法進行比色，根據吸光度繪制洗脫曲線。依據洗脫曲線分別進行收集，再經濃縮、除鹽和冷凍干燥后得到每個多糖組分。

1.4.2 不同分子質量巖藻聚糖硫酸酯的制備及其分子質量的測定

采用稀酸降解法制備不同分子質量的巖藻聚糖硫酸酯。將樣品溶解于不同濃度H2SO4溶液(0.01、0.05、0.10 mol/L)中制成1%的溶液，分別在不同溫度(40、60、80 ℃)下反應，在不同時間點(0、2、4、8 h)下用2 mol/L NaOH終止反應，再經透析，凍干得到降解后樣品。根據不同反應條件，研究稀酸對巖藻聚糖的降解規律，并測定不同時間點巖藻聚糖的分子質量變化，確定酸降解條件。將降解后的組分過Sephacryl S-200HR柱進行分級純化，獲得不同分子質量的巖藻聚糖。

以葡聚糖標準品制備標準曲線，采用高效凝膠色譜法測定降解前后組分的分子質量。取Dextran2000及標準葡聚糖系列各10 mg，溶于1 mL去離子水中，上Sephacryl S-200層析柱，以0.5 mol/L NaCl溶液80 r/min速度洗脫，收集。以分子質量對數(lgMw)對每種標準葡聚糖的洗脫體積與藍色葡聚糖的洗脫體積之比(Ve/Vo)作標準曲線，計算回歸方程。分別再取稀酸降解后的各樣品稀釋至一定濃度后，上樣，測其洗脫體積Ve，根據標準曲線公式計算不同組分的相對平均分子量。

1.4.3 不同分子量巖藻聚糖硫酸酯化學組成測定

總糖含量測定:采用苯酚硫酸法(校正系數為0.9)［7－8］;硫酸基含量測定:采用 Dodgson 法［9］;巖藻糖含量測定:采用Dische比色法［10］;糖醛酸含量測定:采用咔唑比色法［11］;單糖組成測定:采用糖醇乙酸酯衍生物氣相色譜法［12］。

1.4.4 不同分子量巖藻聚糖硫酸酯結構分析

采用美國Nicolet SDXB FT IR紅外光譜儀，將干燥的不同分子質量的多糖樣品與KBr混合、研磨后壓制成厚度1 mm左右的薄片，在4 000～500 cm－1區間進行紅外掃描，檢測不同分子質量的巖藻聚糖組分中多糖特征鍵(基團)的組成［13］。

2 結果與分析

2.1 DEAE-52纖維素離子交換層析法分級純化巖藻聚糖硫酸酯粗品

采用纖維素陰離子交換柱層析法對馬尾藻巖藻聚糖粗品進行分級純化，依次用蒸餾水、1、2、3 mol/L的NaCl溶液洗脫，洗脫曲線見圖1。從圖1中可以看出，蒸餾水和3個濃度的洗脫液處均形成一個糖峰，分別命名為 F0、F1、F2和 F3。F0為中性多糖，是未被纖維素交換的成分，硫酸基含量較少;而F1、F2和F3為酸性多糖，根據硫酸基的含量不同而被不同濃度的洗脫液洗脫下來。從峰面積可以看出，各組分總糖含量有較大差異，其中1 mol/L NaCl溶液的洗脫面積最大，隨著洗脫液濃度的升高，洗脫出的組分總糖含量逐漸減少。

由于F0所含硫酸基較少，F3總糖含量較低，故本文只對F1和F2進行收集和分析。

圖1 馬尾藻巖藻聚糖粗品經DEAE-52柱層析的梯度洗脫曲線Fig.1 The gradient elution curve of crude fucoidan on DEAE-52 column chromalography

2.2 不同分子質量巖藻聚糖硫酸酯的制備及其分子質量測定

2.2.1 不同分子質量巖藻聚糖的制備

在酸降解過程中，反應溫度、酸濃度和反應時間是影響多糖水解速度和分子質量大小的重要因素，本試驗研究了不同的反應溫度(40、60、80℃)、不同的H2SO4濃度(0.01、0.05、0.10 mol/L)和不同反應時間(2、4、8 h)對巖藻聚糖硫酸酯的降解作用，降解后的凝膠色譜圖2～圖4所示。從圖2～圖4中可以看出，最早出現的峰可能是由于分子質量過大而超出柱分離范圍的巖藻聚糖硫酸酯，但隨著溫度、酸濃度的升高和反應時間的延長，第1個峰的峰面積比例不斷縮小，這說明大分子的物質在不斷的降解，因此小分子質量巖藻聚糖不斷增多。另外，在高溫及較高酸度的情況下，降解反應速度較快，不易控制，而且重復率可能較低，故本實驗研究在0.05 mol/L H2SO4、60℃條件下，馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯降解4 h和8 h的情況。

如圖4所示，在60℃、酸濃度為0.05 mol/L、降解4 h時，巖藻聚糖的保留時間為45.02 min，通過公式計算其平均分子質量基本降至15.2 kDa左右;當降解8 h時，保留時間為51.92 min，平均分子質量基本降至7.7 kDa左右。本文根據以上條件分別降解經DEAE-52分級得到的F1和F2，降解后過Sephacryl S-200HR柱，并按時間收集、濃縮、透析和凍干。將F1降解4 h和8 h得到巖藻聚糖命名為MMWF1和LMWF1，將F2降解4h和8h得到的巖藻聚糖命名為MMWF2和LMWF2。

圖2 溫度對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.2 Effect of temperature on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(反應時間1 h、酸濃度0.05 mol/L，3條曲線的反應溫度分別為40、60、80℃)

圖3 酸濃度對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.3 Effect of temperature on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(反應溫度60℃、反應時間1 h，3條曲線的酸濃度分別為0.01、0.05、0.10 mol/L)

圖4 反應時間對馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯酸水解的影響Fig.4 Effect of reaction time on fucoidan from S.wightii acid hydrolysis(酸濃度0.05 mol/L，反應溫度60℃，4條曲線的反應時間分別為0、2、4、8 h)

2.2.2 巖藻聚糖硫酸酯酸降解組分分子質量的測定

利用Sephacryl S-200高效凝膠色譜結合示差光檢測器的方法，得出Dextran2000及標準葡聚糖系列標準曲線，結果如圖5所示。以Ve/Vo為橫坐標、分子質量的對數為縱坐標進行線性回歸分析，得回歸方程lgMw= －1.131 6 Ve/Vo+6.106 5，R2=0.994 7，表明保留時間與分子質量對數之間存在良好的線性關系。

圖5 相對分子質量標準曲線Fig.5 The standard curve of molecular weight of polysaccharide

用同樣方法分別測定 MMWF1、LMWF1、MMWF2、LMWF2所得的洗脫體積Ve，根據標準曲線公式計算出不同組分的相對平均分子質量，結果如表1所示。

表1 馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯不同組分的分子量Table 1 The molecular of different component fucoidan from S.wightii

2.3 不同分子質量巖藻聚糖硫酸酯化學組成分析

表2 不同分子量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的化學組成 %Table 2 The chemical composition of different molecular weight fucoidan from S.wightii %

由表2可知，由于DEAE-52的分級作用，F2的硫酸基含量比F1的高出8.04%，總糖、巖藻糖和糖醛酸含量差異不大。通過分析降解前后各多糖組分化學組成的結果表明，降解后多糖組分總糖、巖藻糖和硫酸基含量的下降較為明顯。這是因為H2SO4能夠斷裂巖藻聚糖硫酸酯中的糖苷鍵，將巖藻聚糖切割成為低分子的片段，與此同時巖藻聚糖硫酸酯中的硫酸基發生部分脫落，且隨著水解時間的增加，硫酸基脫落程度也增加，這與吳永沛等人利用酸水解制備低分子量巖藻聚糖所得結果相符［14］。

將7種單糖標準品分別進行衍生化及GC分析后，記錄每種單糖衍生物的出峰時間，然后進行混標分析，結果如圖6所示。圖6中從左到右，鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)的出峰時間依次為:14.486、14.753、14.997、15.585、25.991、26.594和26.810 min。

不同分子質量的馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯經衍生化及GC分析后，分別得到 MMWF1、MMWF2、LMWF1和LMWF1的氣相色譜圖，如圖7所示。

圖6 標準單糖的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of standard monosaccharid

圖7 不同分子量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of different molecular weight fucoidan from S.wightii

表3 不同分子質量馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的單糖組成 %Table 3 The monosaccharide composition percentage of different molecular weight fucoidan from S.wightii%

由表3及圖7可知，馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯各組分均由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖構成，但百分含量各不相同。MMWF1的半乳糖含量最高，MMWF2的巖藻糖含量最高，LMWF1和LMWF2的甘露糖含量最高。可能是由于糖鏈的斷裂，使單糖的組成百分比發生了變化。

2.4 紅外分析

采用紅外光譜儀在4 000～500 cm－1區間對不同分子質量的樣品進行紅外掃描，檢測不同分子質量的巖藻聚糖組分中多糖特征鍵(基團)的組成，結果如圖8～圖11所示。

通過比較以上紅外光譜圖發現，4組分均含共有的多糖特征峰:3 432～3 482 cm－1處有強吸收峰，這是多糖分子間或分子內氫鍵 O—H的伸縮振動;2 942－2 950 cm－1為甲基的C—H伸縮振動信號，可能是巖藻糖甲基的吸收振動峰;1 613～1 634 cm－1為C═O的伸縮振動，說明結構中均含有一定量的糖醛酸;1 417～1 422 cm－1處的吸收峰為—OH的變形振動，表明多糖為多聚糖;1 250～1 259 cm－1處吸收峰是S═O的伸縮振動，800～860 cm－1處是C—O—S的伸縮振動峰，表明是硫酸基取代的多糖。

圖8 MMWF1的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectra of MMWF1

圖9 MMWF2的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectra of MMWF2

圖11 LMWF2的紅外光譜圖Fig.11 Infrared spectra of LMWF2

MMWF2在1 420 cm－1附近的 C—O—S伸縮振動峰明顯強于其他3個組分，LMWF2次之，與化學分析的結果一致。C—O—S伸縮振動的位置與硫酸基在多糖上的連接位置有關，連接在C2或C3位處于平伏鍵位置的硫酸基在820 cm－1處有吸收，連接在C4位處于直立鍵位置的硫酸基在845 cm－1處有吸收。MMWF1和MMWF2的 C—O—S伸縮振動峰在820 cm－1附近，LMWF1和 LMWF2的伸縮振動峰在836 cm－1附近，這說明MMWF1和MMWF2的硫酸根是連接在C2或C3位的，而LMWF1和LMWF2可能有C4位的硫酸基取代［15－16］。

3 討論

本文采用DEAE-52纖維素離子交換層析法、酸降解法、Sephacryl S-200凝膠法制備得到不同分子質量馬尾藻巖藻聚糖，并對其化學組成進行了詳細分析。據國內外文獻報道，大部分褐藻中的巖藻聚糖硫酸酯均由多種糖殘基構成，富士川龍郎等［17］先后從21種褐藻中提取巖藻聚糖硫酸酯，其中巖藻糖含量(12.9% ～46.2%)、硫酸基含量(14.3% ～38.1%)和糖醛酸含量(0.62% ～20.2%)均不相同。Nishide等［18］對21種日本產褐藻的巖藻聚糖硫酸酯的單糖及糖醛酸組分進行了研究，發現其單糖組分以L-巖藻糖為主，均含有木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖，少數含有阿拉伯糖。

本研究經酸降解后獲得的圍氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯其化學組成與大部分褐藻相似，含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖等其他組分，但均不含阿拉伯糖。其中MMWF1以巖藻糖、半乳糖及葡萄糖為主;MMWF2以巖藻糖和半乳糖為主;LMWF1與LMWF2以巖藻糖和甘露糖為主，這可能與糖苷鍵的不同或糖鏈斷裂有關。另外，四組分均含有多糖的特征吸收峰和硫酸基吸收峰，其平均分子質量分別為16.32、15.49、7.65和7.21 kD，但各組分總糖、硫酸基、巖藻糖等含量均有所降低，這可能與酸降解的脫硫作用及糖鏈斷裂有關。張秀坤［19］的研究表明，采用酸降解方法獲得的低分子質量巖藻聚糖硫酸酯仍具有良好的抗氧化和降血脂活性，本研究可為進一步研究多糖的構效關系提供理論基礎。

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