模糊數學結合響應曲面法優化麻鴨肌原纖維蛋白凝膠工藝*

張志芳，潘道東，2，孫楊贏，曹錦軒，曾小群

1(寧波大學 海洋學院，浙江寧波，315211)2(南京師范大學 食品科學與營養系，江蘇南京，210097)

肌原纖維蛋白質熱誘導凝膠特性是肉制品加工生產中最重要的功能特性之一［1］。肌原纖維蛋白是鹽溶性蛋白，在加熱時能夠形成凝膠，從而影響肉制品的咀嚼性、硬度和出品率等。肌原纖維蛋白熱誘導凝膠特性不僅受蛋白濃度、蛋白分子結構影響，還受加工條件(如加熱溫度、加熱速率)、溶液環境(如pH值、離子強度)等因素的影響［2－4］，因此研究肉制品肌原纖維蛋白熱誘導凝膠特性，對肉制品產品的研發與加工具有重要的意義。麻鴨的蛋白含量高，可食部分鴨肉中的蛋白質含量約16% ～25%，比豬肉、羊肉等畜肉含量高，脂肪和膽固醇較于其他肉類低，是很好的現代養生健康食品［5－6］。然而，現今我國在對肌原纖維蛋白凝膠特性的研究方面，大多以豬肉［7］與雞肉［8］為研究對象。本實驗以麻鴨胸肉為研究材料，研究其肌原纖維蛋白的熱誘導凝膠特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻鴨，購于浙江寧波鎮海江南家禽育種有限公司。(麻鴨日齡為360 d、體重為2 kg，放血去毛取鴨胸脯肉，于－40℃冰箱存放。)

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計，上海雷磁儀器廠;TA-XT2i質構分析儀，StableMicro System公司;美國貝克曼Allerga高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特有限公司;M200全波長酶標儀，美國Tecan公司;XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取制備

肌原纖維蛋白提取參照張玉林［9］方法并稍加改動。取解凍好的鴨胸脯肉加入7.5倍體積的焦磷酸鹽飽和緩沖液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，2 mmol/L Na4P2O7，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，剪碎，勻漿，冷凍離心，去上清取沉淀。將沉淀物重新分散在7.5倍體積的肌原纖維蛋白提取液(100 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L EDTA-2Na，1 mmol/L DTT，10 mmol/L Maleate;pH 6.8)中，勻漿，冷凍離心，取沉淀，提取的沉淀按上述步驟反復提取，最后一次用紗布過濾。將多次提取的沉淀最后用15 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌3次，用紗布過濾即得到純化的肌原纖維蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白熱誘導凝膠制備

參考李亞楠等［10］的方法，略作修改。選取蛋白濃度、pH、NaCl溶液濃度、蛋白凝膠溫度進行單因素實驗，改變其中1個因素，其他3個因素水平保持不變。

蛋白濃度:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白濃度分別稀釋為20、30、40、50、60、70 mg/mL，水浴加熱，從 30 ℃以 0.5 ℃ /min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

溶液pH:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液)將蛋白濃度分別稀釋為40 mg/mL，將溶液 pH 分別調為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

NaCl濃度:用不同濃度的緩沖溶液(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白濃度稀釋到40 mg/mL，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到70℃，保溫40 min，放置4℃冷卻。

凝膠溫度:用緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，30 mmol/L Na2HPO4緩沖溶液，pH 6.5)將蛋白稀釋到40 mg/mL，水浴加熱，從30℃以0.5℃/min線性升溫到 50、60、70、80、90、100 ℃，保溫 40 min，于 4 ℃冷卻。

1.3.3 凝膠保水性測定

參照 Kocher［11］的方法，蛋白形成凝膠后，在3 000 r/min下離心20 min，對離心前后蛋白凝膠和試管進行稱量。蛋白質凝膠的保水性:

WHC/%= ［(m1－m)/(m2－m)］×100

式中:m1為離心后試管與蛋白凝膠的質量;m2為離心前試管和蛋白凝膠的質量;m為離心管質量。

1.3.4 凝膠質構分析測定

參照Marta［12］的方法略有改動。采用TA-XT2i質構分析儀對蛋白凝膠質構特性進行分析，參數設置為:測試探頭(P/5)，測前速度 l.0 mm/s，測試速度l.0 mm/s，剌穿距離3 mm，感應力5 g，停留時間5 s。利用自帶軟件得到蛋白凝膠的相關質構參數:黏性、硬度、彈性。每個指標重復測定5次，取平均值。

1.3.5 蛋白凝膠的綜合素質評定

參照趙紫薇等［13］的方法略作改動。根據蛋白凝膠樣品質量的指標內容，以及保水性、硬度、彈性、黏性4個因素對蛋白凝膠的重要程度的不同。設定權重向量A和蛋白凝膠樣品質量指標集U，計算蛋白凝膠的綜合評價得分。

各個因素的權重向量 A=(a1，a2，a3，a4)=(0.3，0.3，0.2，0.2)，并且 a1+a2+a3+a4=1。

1.3.6 響應曲面分析法實驗

根據Box-Behnken設計原理，選取溶液pH、Nacl濃度、凝膠溫度這3個因素在3個水平上進行響應曲面實驗，響應值為蛋白凝膠的綜合評價得分。共計17組實驗，5個中心點。

表1 響應曲面實驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.3.7 數據處理及分析

本實驗每個數據處理設5個重復，采用SPSS 16.0軟件分析各個因素對凝膠特性的影響程度和顯著性分析，當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 蛋白濃度對蛋白凝膠特性的影響

由圖1可以看出，蛋白凝膠的保水性、硬度、黏性、彈性均隨著肌原纖維蛋白濃度的升高而顯著升高(P＜0.05)。蛋白凝膠的保水性隨著蛋白濃度的增加而升高是因為隨著蛋白質溶解度的增加，高密度蛋白形成的纖維相互交錯，從而形成緊密且穩定的立體狀網絡結構［14］。蛋白凝膠硬度主要取決于蛋白在熱誘導條件下相互交聯的種類和數量，隨著蛋白濃度的增加，蛋白溶解度升高，蛋白相互交聯數量增加，硬度增強。徐幸蓮［15］在研究蛋白質濃度對兔骨胳肌肌球蛋白熱凝膠特性的影響中提出凝膠硬度隨著蛋白濃度的增加而升高，與本試驗的研究結果相一致。

2.1.2 pH值對蛋白凝膠特性的影響

溶液pH值對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響差異極顯著(P＜0.01)。由圖2可知，蛋白凝膠保水性呈現先下降后升高的趨勢，當溶液pH值為5和pH值為5.5時，蛋白凝膠保水性非常低，這是因為溶液pH值靠近肌原纖維蛋白等電點，蛋白質溶解度小。隨著溶液pH值的逐漸升高，蛋白所含靜電荷增加，靜電斥力增加，蛋白質束縛水的能力增強，保水性隨之升高。Lyons等［16］提出隨著溶液pH值的升高，肌原纖維蛋白凝膠保水性增加，與本試驗結果基本一致。

圖1 蛋白濃度對凝膠保水性(a)，凝膠質構特性(b)的影響Fig.1 Effect of protein concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

不同pH條件下，蛋白凝膠硬度差異顯著(P＜0.05)。隨著pH值的增加，蛋白凝膠硬度呈現上升趨勢，這是因為在溶液pH值較低的條件下易于形成細線型的蛋白凝膠，而當溶液pH值較高時則有利于形成顆粒狀的蛋白凝膠。在不同溶液pH值下，彈性的變化不大，差異不顯著。溶液pH對蛋白凝膠黏性的影響差異極顯著(P＜0.01)。當溶液pH值為7.0時，形成的蛋白凝膠黏性最大。

圖2 pH值對凝膠保水性(a)，凝膠質構特性(b)的影響Fig.2 Effect of pH on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.3 NaCl對蛋白凝膠特性的影響

在不同NaCl溶液濃度條件下，蛋白凝膠保水性差異極顯著(P＜0.01)(圖3)。蛋白凝膠保水性隨著NaCl溶液濃度的升高而增加，在NaCl溶液濃度為0.8 mol/L時，上升趨勢變緩，與濃度為0.6、1 mol/L時差異不顯著(P＞0.05)。Bertram 等［17］的研究表明，蛋白凝膠保水性隨溶液離子強度的增加而增加。Chantrapornchai等［18］提出凝膠的保水性，在一定溶液離子強度范圍內，隨著鹽溶液濃度的增加而增加，但鹽濃度過高會導致溶液滲透壓增加，造成蛋白凝膠脫水，凝膠保水性會有所下降。

凝膠硬度隨著NaCl溶液濃度的增加呈現上升趨勢，這是由于蛋白質的溶解度隨著NaCl溶液濃度增加而升高，蛋白交聯數量增多，并且溶液中的Na+、Cl－能夠與蛋白表面的電荷中和，從而進一步促進蛋白質分子之間的相互作用［19］。蛋白凝膠彈性、黏性的變化趨勢跟凝膠硬度大致相同，但其最高點分別為NaCl溶液濃度0.8、0.4 mol/L，而后逐漸降低。

圖3 NaCl溶液濃度對保水性(a)和凝膠質構特性(b)的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

2.1.4 溫度對蛋白凝膠特性的影響

不同加熱溫度條件下，形成的蛋白凝膠保水性差異顯著(P＜0.05)(圖4)。在加熱溫度為50℃時，凝膠保水性很低，這是由于當加熱溫度低于55℃時，蛋白質重鏈及頭部不會形成凝膠結構，只有當溫度高于60℃時，頭部才能促成凝膠網絡結構的形成［20］。在加熱溫度為70℃時，蛋白凝膠保水性最大，隨著溫度進一步升高凝膠保水性呈現下降趨勢，這可能是因為聚集現象使蛋白網絡狀結構破壞，蛋白凝膠失水，凝膠的保水性下降［21］。

圖4 溫度對凝膠保水性(a)和凝膠質構特性(b)的影響Fig.4 Effect of heating temperature on water holding capacity(a)，and textural properties of the gel(b)

凝膠硬度隨著溫度的升高，呈現上升趨勢，在溫度為80℃時硬度達到最大值，這是因為蛋白凝膠硬度與蛋白質變形有關，在一定范圍內，加熱溫度越高，蛋白質變形程度越高，功能基團暴露的就越多，凝膠硬度隨之越大［22］。蛋白凝膠黏性和彈性隨著溫度的升高，呈現下降趨勢，這是因為隨著溫度的升高，蛋白變形加劇，蛋白凝膠膠黏性下降。

2.2 蛋白凝膠樣品綜合評價

根據蛋白凝膠的保水性、硬度、彈性和黏性所占的權重不同，應用公式Y=A×U分別計算出Box-Behnken實驗中的凝膠綜合評價得分。

2.3 響應面實驗設計結果及數據分析

表2為響應面實驗設計及結果。對實驗數據進行二元多次回歸分析，并建立蛋白凝膠綜合評價得分與pH(A)、NaCl濃度(B)、溫度(C)實際值的數學回歸模型 Y=－5.554 1+1.357 7A+1.531 62B+0.025 843C－0.005AB－0.000 2AC－0.003 125BC－0.096 300A2－1.020 62B2－0.000 163 25C2。

分析數據，模型P值＜0.000 1，可知模型極顯著;模型的Lack of Fit的P值為0.088 9，大于0.05。說明模型可用于實際值的預測，試驗方法可靠，能夠滿足響應曲面的分析要求。

由表3還可知，蛋白凝膠綜合評價得分的回歸方程的回歸系數R2=0.987 4，表明有98.74%的數據可以由此方程解釋。影響蛋白凝膠綜合評價得分的一次項主要順序為B(極顯著)＞A(不顯著)＞C(不顯著)。交互項中只有BC存在顯著的交互影響，二次項A2、B2影響極顯著。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and response values

2.4 響應曲面分析

圖5是響應曲面的三維圖。根據表3可知，BC存在顯著的交互影響，分析BC交互影響的響應面圖，隨著NaCl濃度的升高，蛋白凝膠綜合評價得分呈先增大后減小的趨勢;而隨作溫度的升高，蛋白凝膠綜合評價得分在不同NaCl濃度條件下變化趨勢不同。在NaCl濃度為0.4 mol/L時，凝膠綜合評價陣隨溫度的升高平緩的升高;在NaCl濃度為0.6 mol/L時呈先升后下降;而在NaCl濃度為0.8 mol/L時，溫度對凝膠綜合評價影響很小。

圖5 各相互因素對蛋白凝膠綜合評價得分(Y值)影響的響應曲面圖Fig.5 Effects of each factor on Y value by response surface analysis

表3 回歸模型系方差分析表Table 3 Analysis of variance for response surface reduced quadratic model

通過Design-Expert 8.00軟件分析得到蛋白凝膠綜評價得分最高可達到0.543，此時的各因素的工藝條件為:pH值6.96、NaCl濃度0.63 mol/L、凝膠溫度71.57℃。

采用優化后的實驗條件進行驗證實驗，為了方便，參數定為pH 7.0、NaCl濃度0.6 mol/L、凝膠溫度72℃。經過5次平行實驗，最后所得Y值為0.541，與理論值0.543非常接近，可見所確定的模型能夠較好地預測實驗結果。

4 結論

通過單因素實驗和模糊數學結合相應曲面優化法實驗，建立了綜合評價鴨肉肌原纖維蛋白凝膠特性的二次多項式模型。經過實驗驗證，證明通過響應曲面確定的該模型是合理的，能夠較好地預測蛋白凝膠的綜合性質，能夠從Y值對蛋白凝膠特性進行綜合的評價。通過模型分析和實驗修正后得到的最佳工藝參數是:蛋白濃度 40 mg/mL、pH 7.0、NaCl濃度0.6 mol/L、凝膠溫度72℃。該條件下所制備的凝膠的綜合評價得分為0.541。

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