貨架期線椒內(nèi)部品質(zhì)的近紅外漫反射光譜檢測*

潘冰燕，魯曉翔，張鵬，李江闊，陳紹慧

1(天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津，300134)

2(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)

辣椒中葉綠素和類胡蘿卜素的組成及含量不僅影響辣椒的商品價值，也影響其內(nèi)部營養(yǎng)品質(zhì)，是反映辣椒品質(zhì)的重要指標之一。天然類胡蘿卜素在生物體內(nèi)具有抗氧化性，能降低人的癌癥風險、增加免疫能力。西班牙學者的研究表明［1］，辣椒果實成熟過程中大量合成的紅色類胡蘿卜素為辣椒所特有。葉綠素共有葉綠素a、b、c和d四種，在綠色植物中主要為葉綠素a和b。傳統(tǒng)方法對辣椒中葉綠素、類胡蘿卜素的檢測，時間長，操作流程繁瑣，不適合現(xiàn)場對辣椒品質(zhì)的快速檢測。因此，開發(fā)一種簡便、無損的葉綠素、類胡蘿卜素含量快速檢測方法對監(jiān)控物流過程中辣椒品質(zhì)變化具有重要意義［2］。

近紅外光是波長介于可見區(qū)與中紅外區(qū)之間的電磁波，其波長約為800～2 500 nm，波數(shù)約為12 500～4 000 cm－1。利用近紅外光譜技術(shù)(near infrared reflectance spectrum，NIRS)測試樣品，不需預處理就能直接對試樣進行測試，操作方便，非常適合食品的定性和定量的快速分析［3－6］。近年來，NIRS在食品品質(zhì)無損檢測方面得到迅速發(fā)展和應用。Davey等［7］通過近紅外光譜測定香蕉中的類胡蘿卜素含量。郭衛(wèi)東等［8］建立了用于測定櫻桃中糖含量的CWT-GRNN預測校正模型;Park［9］分析了近紅外光譜對水果SSC和硬度的預測水平;石吉勇等［10］利用NIRS對黃瓜植株氮、鎂元素的虧缺進行診斷;果蔬品質(zhì)無損檢測在國內(nèi)外已有一定研究［11］，有的已實現(xiàn)商業(yè)應用，但關(guān)于利用NIRS無損檢測辣椒葉綠素、胡蘿卜素的報道卻鮮見。本文利用NIRS對線椒的葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量進行檢測，建立貨架期線椒鮮果內(nèi)部品質(zhì)快速、無損檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原料:線椒采收時選取成熟度一致(八成熟、綠色)、無病蟲害和機械損傷，并在當天運回實驗室，待線椒的溫度與室溫一致時，用微孔袋(厚度16 μm)包裝。置于常溫(可控溫度為18～20℃)下存放。

每隔24 h進行光譜測定，每次隨機抽取30個樣品，光譜測定后再進行化學成分含量的測定。測定前將辣椒表面拭擦干凈，并對其進行排序編號，之后進行全光譜掃描。剔除異常數(shù)據(jù)之后，試驗共抽取180個數(shù)據(jù)，其中定標集135個和驗證集45個。

1.2 光譜采集

試驗使用NIRSDS2500近紅外漫反射光譜儀(丹麥Foss公司)，采用全息光柵分光系統(tǒng)，信號采集由硅(400～1 100 nm)和硫化鉛(1 100～2 500 nm)檢測器完成，掃描波長范圍為400～2 500 nm，以單波長方式進行快速掃描，掃描次數(shù)為32次，配置Nova分析軟件和WinISI4定標軟件，將每一個線椒樣品的中部凸表面點作為NIR漫反射光譜的采集點，要求避開表面缺陷部位，并對掃描部分進行化學測量。

1.3 葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的化學測定

參考Lichtenthaler等［12］提出的方法，稍做調(diào)整。準確稱取切碎的辣椒鮮果0.500 g，放入研缽中，加入少量的石英砂和CaCO3粉以及2～3 mL的體積分數(shù)(下同)95%乙醇研成勻漿，再加95%乙醇10 mL，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3～5 min，用濾紙過濾到25 mL棕色瓶中，用95%乙醇定容。以95%的乙醇為空白，用紫外分光光度計分別在波長665、649、470 nm下測定吸光度。根據(jù)公式(1)、(2)和(3)進行葉綠素和類胡蘿卜素的百分含量計算。

其中:m，樣品質(zhì)量，g;Ca，葉綠素 a含量，%;Cb，葉綠素 b含量，%;Cx*c，類胡蘿卜素含量，%;D665、D649、D470分別是 665、649、470 nm 下的吸光度值;Ca、Cb和Cx*c分別乘以1 000可得到葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量(按mg/100g計)。

1.4 模型的建立與驗證

利用WinISI4軟件，對原始光譜進行濾波和平滑處理，以去除噪聲，并提取有效信息，采用不同預處理確定線椒葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素無損預測模型;然后，再用未參與定標的樣品對模型進行驗證，評價模型的可行性。為了模型的實用性，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的最小值以及最大值被選入定標樣品集中。以定標集相關(guān)系數(shù)RCV和交叉驗證誤差(standard error of cross validation，SECV)，驗證集相關(guān)系數(shù)RP和驗證標準誤差(standard error of prediction，SEP)為模型的評價標準。通常，所建立模型的RCV和RP越大，SECV和SEP越小，模型的效果越好［13］。本實驗模型定標集和驗證集樣品的分布特征如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)分析基本參數(shù)

選取線椒果實凸表面點做好標記，并對標記點處進行掃描，得到線椒果實的原始近紅外掃描光譜圖1。

表1 定標集和驗證集樣品的分布特征Table 1 Characteristics of calibration and prediction

圖1 貨架期間辣椒原始光譜圖Fig.1 Original absorption spectrum of shelf-life of Line pepper

圖1為貨架期間線椒鮮果的180個原始吸收光譜圖，近紅外光譜會受到化學成分種類和含量的影響，而樣品本身物理性質(zhì)也會影響其光譜。從圖1中可以看出光譜在波長為677、975、1 191、1 448 nm 的處有明顯吸收峰。通過WinISI 4軟件分析可知，在可見光區(qū)，出現(xiàn)第一個明顯的吸收峰(677 nm)，這可能是由果皮葉綠素對光的吸收造成的［14］。而水分對近紅外的吸收帶為960 ～990 nm;1 198 ～1 270 nm［15］。也有研究認為［16］，975 nm和1 448 nm的吸收可能是由水和CO2的吸收引起的。陸婉珍等［17］的研究則認為，果蔬成分中基本化學基團(C—H、O—H)的倍頻吸收譜帶也在這幾個峰附近。這說明近紅外光譜圖捕獲的信息與線椒鮮果內(nèi)在品質(zhì)之間存在著一定的變化規(guī)律。

2.2 不同預處理方法的選擇

采用改進最小偏二乘法(MPLS)，研究光譜不同導數(shù)處理方法結(jié)合不同散射和標準化方法處理模型的方法，從而找出最優(yōu)的模型。在全光譜范圍內(nèi)(400～2 500 nm)比較了原始光譜［Log(1/R)］、一階微分光譜［D1Log(1/R)］、二階微分光譜［D2Log(1/R)］和去散射處理(Detrend)、標準正常化處理(SNV)、SNV和Detrend、標準多元離散校正(standard multivariate discrete calibration，SMSC)、加權(quán)多元離散校正(weighted multivariate discrete calibration，WMSC)相結(jié)合的方法建立的模型。王加華等［18］的研究指出，多元離散校正(MSC)可以解決樣品的不均勻、粒徑大小和光程長短等物理特性對光譜的影響;導數(shù)光譜可對基線和其他背景的干擾進行有效地消除，分辨重疊的峰，達到提高分辨率的效果，但其同時也會引入噪聲，降低信噪比。

本實驗在全光譜范圍內(nèi)比較葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的相關(guān)系數(shù)RCV和交叉驗證誤差SECV，用不同光譜預處理方法建模的結(jié)果如表2所示。

表2 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量不同預處理的定標結(jié)果Table 2 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids by different pretreatment

結(jié)果表明，對于葉綠素a和葉綠素b都是采用MPLS、D1Log(1/R)、Detrend處理的定標模型較好，交互驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)分別為0.907和0.896，交互驗證誤差(SECV)分別為0.744和1.544;對于類胡蘿卜素，采用 MPLS、Log(1/R)、Detrend處理的定標模型較好，交互驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)、交互驗證誤差(SECV)分別為0.902和0.336。

表3 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量最優(yōu)預處理不同波段下的定標結(jié)果Table 3 Statistical results of Chlorophyll a and Chlorophyll b and Carotenoids in best pretreatment at different bands

針對葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量的最優(yōu)預處理進行不同波段的討論，結(jié)果見表3。表明在408～1 092.8 nm波長下建立的模型的交互驗證相關(guān)系數(shù)(RCV)、交互驗證誤差(SECV)略小于全波長建立的模型，而在波長1 108～2 492.8 nm下所建立的模型效果不好。這可能是由于葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的光譜吸收峰大多集中在可見光區(qū)域或短波近紅外區(qū)域，模型的光譜信息主要在這段區(qū)域。

2.3 葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量近紅外檢測模型建立及分析

為了預測定標模型的可靠性和準確性，用建立好的最優(yōu)定標模型分別對45個未知辣椒果實的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量進行預測分析，實測值與預測值相關(guān)性分別如圖2～圖4所示。

預測結(jié)果表明，葉綠素a的預測標準誤差(SEP)為0.894，預測相關(guān)系數(shù)(RP)為0.890 2;葉綠素b的預測標準誤差(SEP)為1.647，預測相關(guān)系數(shù)(RP)為0.923 7;類胡蘿卜素的預測標準誤差(SEP)為0.361，預測相關(guān)系數(shù)(RP)為0.905 9。可見，葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素都可以進行很好的預測。因此，可見/近紅外漫反射對線椒鮮果葉綠素、類胡蘿卜素的快速無損檢測是可行可靠的。

圖2 葉綠素a實測值與預測值相關(guān)性Fig.2 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll a

圖3 葉綠素b實測值與預測值相關(guān)性Fig.3 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of chlorophyll b

圖4 類胡蘿卜素實測值與預測值相關(guān)性Fig.4 Correlation between predicted values of model optimized and actual values of carotenoids

3 結(jié)論

本研究應用近紅外漫反射光譜結(jié)合改進偏最小二乘法(MPLS)建立了線椒鮮果葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的定量模型。MPLS是一種全光譜分析方法，充分利用多個波長下的有用信息，無需刻意地選擇波長，解決交互影響的非線性問題，很適合在近紅外中使用。通過對不同預處理方法模型的比較，得出在MPLS校正模型下，葉綠素a以及葉綠素b最優(yōu)的預處理方法為D1Log(1/R)+Detrend處理，對采集到的原始光譜進行一階導預處理［D1Log(1/R)］，可以過濾噪聲，提高信噪比，消除基線飄移的干擾，提高模型質(zhì)量;類胡蘿卜素的最優(yōu)預處理方法為Log(1/R)+Detrend。可見，去散射處理(Detrend)對這3種組分的模型最優(yōu)，這可能是由于辣椒果皮對近紅外光的透入有較大影響，但這種影響可以通過Detrend處理被減小或被補償，這在趙杰文等［18］的研究中也曾得到證明。葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的最優(yōu)處理方法不同，說明對于不同物質(zhì)間的最優(yōu)模型的預處理方法有所不同。葉綠素b與類胡蘿卜素的預測相關(guān)系數(shù)(RP)都達到了0.9以上，葉綠素a預測相關(guān)系數(shù)(RP)也達到了0.890 2。實驗結(jié)果表明，近紅外漫反射光譜技術(shù)能克服傳統(tǒng)分析方法的繁雜處理過程，實現(xiàn)對辣椒鮮果中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的同時快速無損檢測，從而達到評價線椒貨架期品質(zhì)的目的，而且一次測定可同時預測葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量，實用性更強。本研究方法可利用在對線椒鮮果貨架及貯藏期品質(zhì)的檢測方面。

［1］ Dámaso H M，Ricardo G L G，M Isabel M M.Carotenoid biosynthesis changes in five red pepper cultivars during ripening［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48(9):3 857 －3 864.

［2］ 季淑娟，魏寶東，程順昌.我國蔬菜物流現(xiàn)狀與發(fā)展對策［J］.保鮮與加工，2014，14(4):1－4.

［3］ 張鵬，李江闊，孟憲軍，等.可見/近紅外光譜漫反射無損檢測磨盤柿果實硬度的研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，34(7):423 －425.

［4］ 孫旭東，郝勇，高榮杰，等.臍橙糖度近紅外光譜在線檢測數(shù)學模型優(yōu)化研究［J］.光譜學與光譜分析，2011，31(5):1 230－1 235.

［5］ 王敏，付蓉，趙秋菊，等.近紅外光譜技術(shù)在果蔬品質(zhì)無損檢測中的應用［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26(5):174－178.

［6］ 王丹，魯曉翔，張鵬，等.近紅外光譜檢測不同貯藏期磨盤柿的內(nèi)部品質(zhì)［J］.光譜實驗室，2013，30(6):2 769－2 774.

［7］ Davey M W，Saeys W，Hof E，et al.Application of visible-and near-infrared reflectance spectroscopy(Vis/NIRS)to determine carotenoid contents in banana(Musa spp.)fruit pulp ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(5):1 742 －1 751.

［8］ 郭衛(wèi)東，倪開誠，孫旭東，等.基于CWT和GRNN的可見-近紅外漫反射光譜檢測櫻桃糖度的研究［J］.食品科學，2009，30(12):140 －142.

［9］ Park B，Abbott J A，Lee K J，et al.Near-infrared diffuse reflectance for quantitativeand qualitative measurement of soluble solids and firmness of Delicious and Gala apples［J］.Transactions of the ASAE，2003，46(6):17 －21.

［10］ 石吉勇，鄒小波，趙杰文，等.近紅外光譜技術(shù)快速無損診斷黃瓜植株氮、鎂元素虧缺［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2011，27(8):283 －287.

［11］ XU Hui-rong，QI Bing，SUN Tong，et al.Variable selection in visible and near-infrared spectra:Application to on-line determination of sugar content in pears［J］.Journal of Food Engineering，2012，109(1):142 －147.

［12］ 張其德.測定葉綠素的幾種方法［J］.植物學通報，1985，3(5):60 －64.

［13］ 王丹，魯曉翔，張鵬，等.近紅外漫反射光譜檢測不同貯藏期甜柿的內(nèi)部品質(zhì)［J］.食品科技，2013，38(11):264－271.

［14］ Cayuela J A.Vis/VIR soluble solids prediction in intact oranges(Citrus sinensis L.)cv.valencia late by reflectance［J］.Postharvest Bid Technol，2008，47(1):75 －80.

［15］ Wiliams P，Norris K H.Variable affecting near infrured spectroscopic analysis.In:WiliamsP，NorrisK H.(Eds.).Near Infrured Technalogy in the Agricuture and Food Industries［M］(Seconed).St.Paul，MN:The American Association of Cereal Chemist，2001:171 － 185.

［16］ 王寶剛，李文生，蔡宋宋，等.核果類水果干物質(zhì)含量近紅外無損檢測研究［J］.光譜實驗室，2010，27(6):2 118－2 123.

［17］ 王加華，孫旭東，潘璐，等.基于可見/近紅外能量光譜的蘋果褐腐病和水心鑒別［J］.光譜學與光譜分析，2008，28(9):2 098 －2 102.

［18］ 趙杰文，張海東，劉木華.利用近紅外漫反射光譜技術(shù)進行蘋果糖度無損檢測的研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2005，21(3):162 －165.