響應面優化牛蒡子多糖的提取及其抗氧化活性研究*

喻俊，王濤，賈春紅，孫繼業，胡尚欽，張利

1(四川農業大學理學院，四川雅安，625014)2(四川農業大學林學院，四川 雅安，625014)3(四川輔正藥業有限責任公司，四川 成都，611730)4(四川省農科院中藥材研究中心，四川簡陽，641400)

牛蒡子(Fructus arctii)為菊科(Asteraceae)植物牛蒡(Arctium lappa L.)的果實。始載于《本草圖經》，其味辛苦、性寒、歸肺胃二經，具有疏散風熱、祛痰止咳、解毒透疹、利咽消腫等功效［1］。牛蒡子的功效成分主要有多糖類、木質素類、生物堿、揮發油和脂肪酸等［2］。牛蒡子具有抗腫瘤［3］、抗炎、抗糖尿病［4］、抗流感病毒和治療腦缺血［5］等作用。目前國內外對牛蒡子的研究主要集中于木質素類和多酚類等化學成分的鑒定及藥理功能上［6－7］，有關牛蒡子多糖(polysaccharides from fructus arctii，簡稱FAP)的研究較少，關于青蒿、紅花等菊科植物多糖研究較多，研究發現多種菊科類植物具有抑制癌癥［8］、調節免疫［9］、抗氧化［10］等作用。本研究采用超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖，響應面優化法優化提取工藝，對牛蒡子多糖的抗氧化活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

牛蒡子，采自四川簡陽牛蒡種植基地;葡萄糖(AR)、苯酚(AR)、濃 H2SO4(AR)、95% 乙醇(AR)，成都市科龍化工試劑廠;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、四唑氮藍(NBT)、還原型輔酶 I鈉鹽(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)，美國Sigma;所用水均為超純水。

CP-114電子天平，上海洪紀儀器設備有限公司;SB-600DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司;LGJ-12冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司;UV-1600PG紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;GL-22MS高速冷凍離心機，匡貝實業有限公司;SA-205傅里葉交換光譜分析儀，Thorlabs公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗

取體積分數80%乙醇脫脂后干燥粉末10 g置于圓底燒瓶中，加水混合均勻后400 W超聲25 min，之后水浴加熱提取牛蒡子多糖。以牛蒡子多糖提取率為指標，分別對液固比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL∶g)、提取時間(1、2、3、4、5 h)、提取溫度(60、70、80、90、100℃)對提取率的影響進行了研究和分析，確定各因素提取的最佳條件。

1.2.2 多糖含量和提取率測定

提取溶液中多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法［11］。取0.1 mL的提取液于試管中，加水至2.00 mL，加入6%苯酚溶液1.00 mL，搖勻，迅速加入濃H2SO45.00 mL，搖勻放置20 min。在490 nm波長處測定吸光度。根據多糖濃度與吸光度作圖得標準曲線，回歸方程為y=6.942x+0.029 9(R2=0.994)，計算可溶性多糖的含量。

1.3 響應面試驗設計優化

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken design對超聲波輔助熱水提取進行響應面優化，以固液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，以牛蒡子多糖提取率為響應值，確定3因素3水平的最佳參數進行響應面分析，試驗設計中的水平及編碼表見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 牛蒡子多糖的紅外光譜測定

取最優條件提取的牛蒡子多糖2 mg與100 mg KI在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片機壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀中在4 000～450 cm－1波數范圍內掃描，觀察記錄譜峰［12］。

1.5 牛蒡子多糖的抗氧化活性研究

1.5.1 對DPPH·的清除作用

采用DPPH氧化法，用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考聶少平［13］等人的方法測定牛蒡子多糖對DPPH·的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的DPPH溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與DPPH混合溶液的吸光度;Aj表示不加DPPH溶液的樣品溶液的吸光度。

1.5.2 對羥基自由基(·OH)的清除作用

用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考吳蘭芳［14］等人采用水楊酸法測定牛蒡子多糖·OH的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的混合反應溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與混合反應溶液的吸光度;Aj表示不加水楊酸混合反應溶液的吸光度。

1.5.3 對超氧陰離子(O2－·)的清除作用

用NBT顯色法測定，PMS/NADH體系會產生超氧自由基。用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液，參考宋坤［15］等人采用 NBT顯色法測定牛蒡子多糖對O2－·的清除能力，以Vc做陽性對照。每個樣品重復3次，求平均值。計算公式如下:

式中:Ao表示水代替樣品溶液的混合反應溶液的吸光度;Ai表示樣品溶液與混合反應溶液的吸光度。

1.5.4 還原力的測定

用超純水將多糖配成不同濃度(0.02～2 mg/mL)的多糖溶液。參考WANG［16］等人采用鐵離子總還原力測定方法測定牛蒡子多糖的還原能力，以Vc作為陽性對照。每個樣品重復3次，求平均值。

1.6 數據分析

采用Excel 2013和Origin 8.0分析軟件對單因素試驗中的各因素進行比較分析，采用Design-Expert 8.0數據處理軟件進行響應面設計和分析。所有試驗均重復3次，以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液固比對牛蒡子多糖提取率的影響

液固比是影響多糖提取率因素之一，不同液固比對牛蒡子多糖提取率的影響如圖1。

圖1 固液比Fig.1 Effect of ratio of water to raw material

由圖1可以看出，隨著液固比的增大，牛蒡子多糖的提取率先隨著液固比的增大而增大，當液固比達到20∶1以后，牛蒡子多糖的提取率隨著液固比的增加基本不變。選擇最佳液固比20∶1(mL∶g)。

2.1.2 提取時間對牛蒡子多糖提取率的影響

如圖2所示，在1～3 h內多糖的提取率隨時間的增加而增加，3 h時多糖的提取率為最大值5.87%。隨后增長提取時間，多糖的提取率基本趨于不變。這可能是由于時間的延長，牛蒡子多糖不斷被溶出，使得提取率上升，但提取時間過3 h以后，多糖已基本溶出，多糖提取率隨著提取時間的增加基本不變。選擇提取時間3 h為宜。

圖2 提取時間對牛蒡子多糖提取率的影響Fig.2 Eeffect of extraction time on the yield of FAP

2.1.3 提取溫度對牛蒡子多糖提取率的影響

從圖3可以看出，隨著提取溫度的上升，牛蒡子多糖的提取率先增加后減少，當提取溫度為80℃時，多糖的提取率最高，當溫度繼續升高多糖的提取率緩慢減少，溫度的升高可提高牛蒡子多糖的溶解度和多糖從組織中的滲出速率。但溫度過高則可能導致多糖分解，從而影響牛蒡子多糖的滲出。提取溫度選擇80℃為宜。

圖3 提取溫度對牛蒡子多糖提取率的影響Fig.3 Eeffect of extraction temperature on the yield of FAP

2.2 提取條件的優

2.2.1 響應面試驗結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，綜合分析單因素，選取對牛蒡子多糖提取率有影響的固液比、提取時間、提取溫度3因素，設計3因素3水平的響應面分析試驗。

使用Design Expert 8.0軟件，以固液比、提取時間、提取溫度為響應變量，以牛蒡子多糖提取率為響應面值對表2的數據進行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性回歸的二項式擬合，得到預測模型如下:

多糖提取率(Y)/%=6.32+0.28A+0.17B+0.54C+0.055AB－0.18AC－0.12BC－0.56A2－0.44B2－0.64C2

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3為回歸分析結果，該回歸模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項(P＞0.05)不顯著，決定系數R2=0.983 8，=0.963 1，說明該模型與實際擬合較好，誤差較小，自變量與響應面值之間線性關系顯著，可以用于牛蒡子多糖提取工藝試驗的預測。各因素的影響程度分析，由回歸系數檢驗值F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F值越大，表明該因素影響多糖提取率越大。FA=35.20，FB=12.30，FC=129.75，即各因素對提取率的影響程度大小順序為:提取溫度＞液固比＞提取時間。該模式的變異系CV=2.4%，在可接受范圍之內［17－18］。

表3 回歸方程模型顯著性分析表Table 3 Significance testfor cofficients of the regression model developed

2.2.2 響應面分析

根據回歸方程，做出響應面分析圖和等高線圖。如圖4所示。等高線的形狀可以反映出2個因素交互作用的強弱，橢圓形與圓形可以表示交互作用的顯著與不顯著。由圖4可知，固液比與提取時間交互作用不顯著，固液比與提取溫度的交互作用較顯著，提取時間與提取溫度交互作用也較顯著。在本實驗中，提取溫度是影響牛蒡子多糖提取率的最重要的因素，次之為固液比，提取時間影響最小。

圖4 響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots

2.2.3 提取工藝條件的驗證

通過得出的模型，超聲波輔助熱水提取牛蒡子多糖的最優條件為:液固比為19.8∶1(mL∶g)，提取時間為3.1 h，提取溫度為85.1℃，提取率為6.43%。為了驗證模型的有效性，按最佳提取條件提取，試驗重復3次驗證，平均得率為6.40%，與理論值偏差小于0.33%。說明通過響應面設計優化后得到的最優條件參數可靠，能較好的預測實驗得率。

2.3 牛蒡子多糖的紅外光譜分析

光譜是研究多糖官能團的有效手段，通過對特征峰的分析，可以初步判斷多糖的官能團。牛蒡子多糖的紅外光譜圖如圖5所示。3 400－1波數處為多糖的-OH的伸縮振動峰，2 900-1波數處為C-H的伸縮振動峰，在1 600－1波數為 C ═ O 的伸縮振動［19］，在 950－1 200－1波數處的吸收峰為 C—O—H和C—O—C的變角振動［20］，在 600～800－1有吸收，表明該多糖由-吡喃糖苷鍵連接［21］。由此可知，牛蒡子多糖具有典型的多糖特征吸收峰［22］。

圖5 牛蒡子多糖的紅外光譜圖Fig.5 The IR spectra ofFAP

2.4 牛蒡子多糖的體外抗氧化活性評價

(1)DPPH自由基的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對DPPH·的清除作用如圖6(a)所示。由圖6-(a)可知，牛蒡子多糖對DPPH·具有一定的清除作用。在濃度0.2～2 mg/mL內，牛蒡子多糖和Vc對DPPH·的清除能力隨濃度的增大而增大，牛蒡子多糖對DPPH·的清除能力由15.2%增至80.8%，具有量效關系，計算出牛蒡子多糖對DPPH·的IC50值為1.05 mg/mL。

(2)對·OH的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對·OH的清除作用如圖6(b)所示。由圖6-(b)可知，在濃度0.2～2 mg/mL內，牛蒡子多糖和Vc對·OH自由基的清除能力隨濃度的增大而增大，牛蒡子多糖對·OH自由基的清除能力隨著濃度的增大由11.34%增至70.69%。計算出牛蒡子多糖對·OH自由基的IC50值為1.21 mg/mL。

(3)對O2－·的清除作用。牛蒡子多糖和Vc對·的清除作用如圖6(c)所示。由圖6(c)可知，在濃度0.2～2 mg/mL內，牛蒡子多糖和Vc對·自由基的清除能力隨濃度的增大而增大。在濃度0.2～2 mg/mL范圍內，牛蒡子多糖對O2－·陰離子的清除能力隨著濃度的增大由10.8%增至68.3%。計算出牛蒡子多糖對O2－·陰離子的IC50值為1.25 mg/mL。

2.4.4 還原力測定

抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在一定的關系，抗氧化劑是通過自身的還原作用給出2個電子而清除自由基，還原力越強，抗氧化性越強。因此，可通過測定還原力來說明其抗氧化性的大小。牛蒡子多糖和Vc的還原力如圖7所示。牛蒡子多糖和Vc的還原能力隨濃度的增大而增大，在濃度0.2～2 mg/mL內，牛蒡子多糖的還原能力隨著濃度的增大由12.2%增至58.3%，還原力表現出量效關系。根據計算，IC50值為1.43 mg/mL。

圖6 牛蒡子多糖和Vc對DPPH清除作用(a)，·OH清除作用 (b)，O2－·清除作用 (c)，Fig.6 Scavenging effect of FAP and Vc on DPPH radical(a)，on hydroxyl radical(b)，on superoxide anion free radical(c)

圖7 牛蒡子多糖和VC的還原能力Fig.7 Scavenging effect of FAP and Vc on reducing power

3 結論

本研究建立了超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖的最佳工藝條件，即液固比19.8∶1(mL∶g)、提取時間3.1 h、提取溫度85.1℃，該最優條件下牛蒡子多糖的提取率為6.43%，驗證值為6.40%，表明該模型合理可靠，能較好的預測超聲波輔助熱水法提取牛蒡子多糖的提取率。在測定的質量濃度范圍內，牛蒡子多糖清除DPPH·、·OH、O2－·和還原力均隨著質量濃度的增大而增大，清除DPPH·、·OH、和還原力的半數有效濃度(IC50)分別為1.05、1.21、1.25和1.43 mg/mL。牛蒡子多糖表現出較好的抗氧化活性，可以作為一種天然抗氧化劑應用在食品和保健品工業中。

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