醒腦靜注射液對全腦缺血再灌注大鼠血腦屏障ZO-1表達的影響*

鐘志越，李　炳，劉　明，李宏治，梁曉俊，申　捷(復旦大學附屬金山醫院化學傷害救治中心ICU，上海201508)

醒腦靜注射液對全腦缺血再灌注大鼠血腦屏障ZO-1表達的影響*

鐘志越，李炳，劉明，李宏治，梁曉俊，申捷△
(復旦大學附屬金山醫院化學傷害救治中心ICU，上海201508)

［摘要］目的:探討醒腦靜( XNJ)注射液對大鼠全腦缺血再灌注后血腦屏障通透性及緊密連接蛋白1( ZO-1)表達的影響。方法:采用改良Pulsinelli四血管閉塞法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。將雄性Wistar大鼠隨機分為4組，即假手術組、全腦缺血再灌注模型組、溶劑對照組和XNJ組。每組均在缺血再灌注后24 h、48 h和72 h處理。用干濕重法測定腦組織中水含量，分光光度計法檢測腦組織伊文思藍( EB)含量，Western blot檢測大腦皮層的ZO-1蛋白含量。結果:缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均顯著高于假手術組( P＜0.05)，但在缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組腦組織含水量顯著高于XNJ組和假手術組( P＜0.05)。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內EB含量均高于假手術組( P＜0.05)，缺血再灌注后48 h和72 h，假手術組和XNJ組的EB含量顯著低于模型組和溶劑對照組( P＜0.05)。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達水平顯著低于假手術組( P＜0.05)，同樣缺血再灌注后48 h和72 h，假手術組和XNJ組皮層中ZO-1蛋白含量顯著高于模型組和溶劑對照組( P＜0.05)。結論:在缺血再灌注后的48 h和72 h，醒腦靜注射液對血腦屏障具有保護作用，可能與醒腦靜注射液上調ZO-1蛋白的表達有關。

［關鍵詞］醒腦靜注射液;缺血再灌注;血腦屏障;緊密連接蛋白1

腦缺血再灌注往往造成一系列嚴重的病理生理性損傷。腦缺血后的腦水腫［1－2］包括細胞毒性( cytotoxic)和血管源性( vasogenic) 2種，前者在缺血期間已啟動，屬細胞內水腫，在再灌注后可繼續加重。當缺血達到一定時限，腦血管內皮細胞損傷，血腦屏障( blood-brain barrier，BBB)受損，腦毛細血管通過性增加，血漿蛋白與水分外溢，細胞外液增加，造成間質性腦水腫，即謂血管源性腦水腫。因此腦缺血再灌注后所導致的血腦屏障的破壞以及通透性的增大是導致腦水腫及腦損傷的重要環節［3］。目前在臨床上應對腦缺血再灌注損傷，有效控制腦水腫，減少血腦屏障的滲漏，是治療成功的關鍵。醒腦靜( Xingnaojing，XNJ)是在安宮牛黃丸的基礎上精制而成的一種注射液，主要配方為麝香、郁金、冰片、梔子，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦之效，對于腦缺血再灌注損傷有很好的療效［4］，但對其治療機制并未進行深入研究。本研究的目的就是從腦缺血再灌注損傷后的腦水腫入手，探討醒腦靜對血腦屏障的影響，尤其是對血腦屏障緊密連接的主要構成成分緊密連接蛋白1( zonula occludens-1，ZO-1)表達的影響。

材料和方法

1材料

1.1實驗動物與分組健康成年雄性Wistar大鼠216只，體重200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。隨機分為4組，每組54只:即假手術組( sham group) ;全腦缺血再灌注模型組( model group) ;全腦缺血再灌注+溶劑對照組( solvent group) ;全腦缺血再灌注+醒腦靜干預組( XNJ group)。每組又分3個時點即再灌注后24 h、48 h和72 h進行處理，每個觀察點18只，分別進行腦組織中水含量測定、伊文思藍( Evans blue，EB)染色及ZO-1蛋白檢測。

1.2主要試劑與設備醒腦靜注射液(無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司) ; EB購自Sigma; ZO-1 I 抗( Abcam) ; Epoch酶標儀( BioTek)。

2方法

2.1大鼠全腦缺血再灌注模型的制備采用改良Pulsinelli四血管閉塞法［5］。10%水合氯醛麻醉，大鼠固定于操作臺，頸后備皮、消毒，于第1頸椎水平作1～2 cm的縱形切口，分離筋膜、肌肉，暴露第1頸椎翼突孔，電凝雙側椎動脈造成椎動脈永久性閉塞，消毒縫合切口。翻轉大鼠仰臥位固定，于頸前正中作切口，分離雙側頸總動脈，穿線打一活結埋于皮下備用，消毒縫合。24 h后不行麻醉固定，用無損傷微動脈夾夾閉雙側頸總動脈持續10 min，造成大鼠全腦缺血。出現瞳孔散大、翻正反射消失立即撤去動脈夾恢復腦血流，消毒縫合切口。

2.2給藥模型完成后立即腹腔注射醒腦靜注射液10 mL·k g－1·d-1( XNJ組) ;而solvent組于模型完成后立即腹腔注射同等量的生理鹽水; model組不給予干預; sham組完成切口，分離但不結扎和凝閉血管。

2.3干濕重法測定腦組織中水含量［6］各組大鼠麻醉后，立即斷頭取腦，經電子天平精確稱重后，放入110℃恒溫干燥箱烘烤24 h至恒重( 2次稱重差別＜0.2 mg)后，用同一電子天平再精確稱干腦組織重量，并按照Eliot干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量( %) = (濕重－干重) /濕重×100%。

2.4伊文思藍染色檢測血腦屏障通透性參照文獻［7］的方法進行，從大鼠尾靜脈注入2%的EB溶液( 5 mL/kg體重)，5 h后麻醉左心室灌注生理鹽水300 mL，取腦，做2 mm厚冠狀切片，并用電子天平分別精確稱其濕重后，置于二甲基甲酰胺溶液，37℃水浴48 h取出，5 000 r/min離心取上清液，并再次離心取200 μL上清液加入酶標板中，酶標儀用波長632 nm測定吸光度。稱取EB 4 mg，加生理鹽水至總容積25 mL，取0.3 mL加入5.7 mL二甲基甲酰胺中混勻作為第1管;倍比稀釋得濃度依次為8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.25 mg/L。37℃水浴孵育48 h后比色(λ= 632 nm)測定吸光度，制作出標準曲線。

2.5Western blot檢測ZO-1蛋白含量各組大鼠麻醉取腦后，取皮層腦組織勻漿后提取總蛋白，測濃度后，進行SDS-PAGE，然后轉膜，經兔抗鼠I抗孵育后，加II抗孵育，化學發光后壓片曝光，SYNGENE生物圖像系統拍照及數據處理。

3統計學處理

實驗數據以均數±標準誤( mean±SEM)表示，應用SPSS 13.0軟件進行統計，采用單因素方差分析( one-way ANOVA)和隨機區組的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組大鼠在缺血再灌注后24 h、48 h和72 h腦組織中的含水量

結果如表1所示，缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均高于假手術組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織含水量開始顯著高于假手術組和XNJ組( P＜0.05)。

表1　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦組織中含水量的變化Table 1.The change of water content 24 h，48 h and 72 h after ischemia-reperfusion in brain tissue of rats( %.Mean ±SEM.n =6)

2 EB染色及EB含量測定

EB在正常情況下與血漿白蛋白結合不能著色;當腦缺血再灌注損傷后由于BBB破壞，通透性增加，EB會通過血管壁進入腦組織而著色，因此EB可作為示蹤劑對BBB破壞進行定量評價。實驗結果顯示模型組、溶劑對照組和XNJ組均有EB的滲漏，說明均有血腦屏障的破壞。在缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內EB含量均顯著高于假手術組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織內EB含量顯著高于假手術組和XNJ組( P＜0.05)，且XNJ組又顯著高于假手術組( P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Change of EB 24 h，48 h and 72 h after ischemiareperfusion in brain tissue of rats.Mean±SEM.n = 6.*P＜0. 05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖1　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦組織中EB含量的變化

3 缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠皮層中ZO-1的表達情況

缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達水平顯著低于假手術組( P＜0.05)。缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組皮層中的ZO-1蛋白表達水平仍比較低，但XNJ組的ZO-1蛋白表達逐漸升高。經統計學比較，缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組皮層中的ZO-1蛋白表達水平顯著低于假手術組和XNJ組( P＜0.05)，但XNJ組又顯著低于假手術組( P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Change of ZO-1 24 h，48 h and 72 h after ischemiareperfusion in brain cortex of rats.Mean±SEM.n = 6.*P＜0. 05 vs sham group;#P＜0.05 vs model group.圖2　缺血再灌注后24 h、48 h和72 h各組大鼠腦皮層中ZO-1蛋白表達的變化

討論

血腦屏障［8］是主要由腦微血管內皮細胞( brain microvascular endothelial cell，BMEC)、細胞間緊密連接( tight junction，TJ)、連續的基底膜和基底外側的星形膠質細胞終足等結構構成，并保持中樞神經系統內環境的相對穩定。腦缺血再灌注可導致血腦屏障破壞，通透性增加，炎性因子及有害物質進入腦組織，引起腦水腫形成，從而加重腦損傷。腦缺血發生的時候，伊文思藍出現在缺血區，表明BBB通透性增加;腦組織相對含水量可用于估計大鼠腦水腫的程度。張紅波等［9］通過腹腔注射醒腦靜小劑量組( 3. 33 mL/kg)、中劑量組( 6.66 mL/kg)、大劑量組( 10 mL/kg)初步觀察發現，醒腦靜注射液對腦組織的保護作用存在較明顯的量效關系。本實驗采用腹腔注射醒腦靜注射液10 mL·kg-1·d-1，結果顯示:大鼠全腦缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組的腦組織含水量均顯著高于假手術組，但在缺血再灌注后48 h和72 h，模型組和溶劑對照組的腦組織含水量顯著高于XNJ組和假手術組。缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦組織內伊文思藍( EB)含量均高于假手術組，缺血再灌注后48 h和72 h，假手術組和XNJ組的EB含量顯著低于模型組和溶劑對照組。提示全腦缺血再灌后出現腦水腫和血腦屏障的通透性增加，醒腦靜有穩定血腦屏障通透性、減輕腦水腫的作用。

血腦屏障的物質轉運一般有2種途徑:跨細胞途徑和細胞旁途徑。細胞間緊密連接是BBB最主要的物質結構基礎，它能夠封閉內皮細胞頂部的細胞間隙，阻止細胞外的大分子物質經細胞間隙進入組織內，是細胞間的通透屏障，通過細胞旁路徑調控水、離子和大分子物質的跨膜轉運。血腦屏障細胞旁途徑是主要通過調節ZO-1、occludin和claudin-5等緊密連接相關蛋白和黏附連接蛋白等結構，開放緊密連接，增加血腦屏障的通透性［10］。Preston等［11］通過計算BBB對大分子示蹤劑和水分子示蹤劑通透性的轉運常數發現，大鼠短暫性腦缺血再灌注后BBB通透性的增加主要是由TJ開放導致，而并非是胞飲轉運增強。ZO-1是緊密連接的重要結構蛋白，不僅表達于緊密連接，也表達于黏附連接，對緊密連接的形成和定位都有重要作用，研究表明ZO-1的缺失會導致緊密連接結構的破壞，其水平的高低與BBB的開放、關閉關系密切［8］，實驗通過Western blot檢測ZO-1蛋白的表達顯示，缺血再灌注后24 h，模型組、溶劑對照組和XNJ組大鼠腦皮層中的ZO-1蛋白表達水平顯著低于假手術組，同樣缺血再灌注后48 h和72 h，假手術組和XNJ組皮層中的ZO-1蛋白含量顯著高于模型組和溶劑對照組。提示全腦缺血再灌后ZO-1蛋白表達水平下降，醒腦靜能使表達降低的ZO-1蛋白顯著上調，起到了保護BBB的作用，這可能是醒腦靜注射液發揮對腦缺血再灌注后BBB保護作用的機制之一。醒腦靜射液對其它緊密連接相關蛋白是否有影響待進一步研究。

醒腦靜注射液是臨床常用的中成藥急救藥品，該藥具有醒腦開竅、清熱涼血、行氣活血和解熱止痛等功效［12］，靜脈給藥后可通過血腦屏障直接作用于中樞神經系統，具有興奮中樞、解熱、鎮痛、抑菌、抗炎、保肝的藥效。本實驗表明，醒腦靜能上調ZO-1蛋白的表達，穩定血腦屏障通透性，減輕腦水腫。

［參考文獻］

［1］王耀明，莫雪安，童萼塘，等.腦缺血再灌注后大鼠血腦屏障通透性的熒光定量分析［J］.中國病理生理雜志，2002，18( 8) : 1020-1022.

［2］Kiening KL，van Landeghem FK，Schreiber S，et al.Decreased hemispheric aquaporin-4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats［J］.Neurosci Lett，2002，324( 2) : 105-108.

［3］Liu Y，Wang D，Wang H，et al.The protective effect of HET0016 on brain edema and blood-brain barrier dysfunction after cerebral ischemia/reperfusion［J］.Brain Res，2014，1544: 45-53.

［4］李芳君，謝少玲.醒腦靜注射液對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用［J］.中藥材，2011，34( 7) : 1111-1113.

［5］Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10( 3) : 267-272.

［6］Ren C，Gao M，Dornbos D，et al.Remote ischemic postconditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury［J］.Neurol Res，2011，33( 5) : 514-519.

［7］Huang P，Zhou CM，Qin-Hu，et al.Cerebralcare Granuleattenuates blood-brain barrier disruption after middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Exp Neurol，2012，237( 2) : 453-463.

［8］Mark KS，Davis TP.Cerebral microvascular changes in permeability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，282 ( 4) : H1485-H1494.

［9］張紅波，代建，張賓輝.醒腦靜注射液對腦缺血再灌注氧化損傷的實驗研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2006，30( 3) : 233-237.

［10］Abbott NJ，Patabendige AA，Dolman DE，et al.Structure and function of the blood-brain barrier［J］.Neurobiol Dis，2010，37( 1) : 13-25.

［11］Preston E，Foster DO.Evidence for pore-like opening of blood-brain barrier following forebrain ischemia in rats ［J］.Brain Res，1997，761( 1) : 4-10.

［12］張路晗，向金蓮，程睿，等.醒腦靜注射液的藥效學研究［J］.華西藥學雜志，2001，16( 6) : 429-431.

Effects of Xingnaojing injection on expression of ZO-1 in blood-brain barrier after global ischemia-reperfusion

ZHONG Zhi-yue，LI Bing，LIU Ming，LI Hong-zhi，LIANG Xiao-jun，SHEN Jie
( Intensive Care Unit，Chemical Injury Treatment Center，Jinshan Hospital，Fudan University，Shanghai 201508，China.E-mail: j1999sh@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of Xingnaojing ( XNJ) injection on the permeability of blood-brain barrier ( BBB) and zonula occludens-1 ( ZO-1) protein expression after global ischemia-reperfusion in rats.METHODS: Improved Pulsinelli four-vessel occlusion method was adopted to establish the global ischemia-reperfusion model in the rats.Male Wistar rats were randomly divided into sham group，model group，solvent group and XNJ group.The observations were conducted at the time points of 24 h，48 h and 72 h after ischemia reperfusion.The water content of the brain tissues was determined by dry-wet weight method，while the Evans blue ( EB) content of brain tissue was detected by spectrophotometry.The protein levels of ZO-1 in the cerebral cortex were analyzed by Western blot.RESULTS: The water contents in the brain tissues in model group，solvent group and XNJ group were significantly higher than those in sham group ( P＜0.05) 24 h after ischemia reperfusion.However，the brain water contents in model group and solvent group were significantly higher than those in XNJ group and sham group ( P＜0.05) 48 h and 72 h after ischemia reperfusion.The EB contents in the brain tissues in model group，solvent group and XNJ group were entirely higher than that in sham group 24 h after ischemia reperfusion ( P＜0.05).The EB contents in sham group and XNJ group were significantly lower than those in model group and solvent group 48 h and 72 h after ischemia reperfusion ( P＜0.05).The protein expression of ZO-1 in the rat cerebral cortex in model group，solvent group and XNJ group was significantly lower than that in sham group 24 h after ischemia-reperfusion ( P＜0.05).Similarly，48 h and 72 h after ischemia reperfusion，ZO-1 protein level in the cortex in sham group and XNJ group was significantly higher than that in model group and solvent group ( P＜0.05).CONCLU-book=1321,ebook=177SION: At 48 h and 72 h after global ischemia-reperfusion，Xingnaojing injection play a protective role in blood-brain barrier and this role may be associated with the increase in ZO-1 protein expression by Xingnaojing injection.

［KEY WORDS］Xingnaojing injection; Ischemia-reperfusion; Blood-brain barrier; Zonula occludens-1 protein

通訊作者△Tel: 021-34189990; E-mail: j1999sh@163.com

*［基金項目］上海市衛生局中醫藥科研基金資助項目( No.2012J018B)

［收稿日期］2014-10-14［修回日期］2015-04-24

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1320-04

［中圖分類號］R363. 2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.030