藻藍蛋白誘導喉癌HEP-2細胞凋亡的實驗研究*

應 俊， 潘若望， 王茂峰， 陳吉順， 劉 倩， 張洪勤， 包其郁， 李佩珍△

(1溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院，浙江溫州325035;2中國人民解放軍第118醫院，浙江溫州325000;3溫州醫科大學附屬東陽醫院，浙江東陽322103)

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤的5.7% ～7.6%，占耳鼻喉科惡性腫瘤的7.9%～35.0%，環境污染的增加和不良生活習慣使我國各地的喉癌發病率呈上升趨勢［1］。對喉癌的治療目前主要還是手術、放療、化療，但對于中晚期喉癌患者，預后仍不夠理想且副作用太大。歐洲癌癥研究與治療組織(EORTC)頭頸合作組進行了以順鉑和氟尿嘧啶為主的誘導化療方案，結果表明在沒有影響總生存率的前提下，患者的喉保留率54.0%，遠處轉移率明顯降低［2］。但由于化療藥物副作用大，無法大劑量的使用，從而限制了腫瘤的治療手段。因此，發現并篩選新的高效低毒的化療藥物己成為當今腫瘤治療研究的重點。

藻藍蛋白(phycocyanin，PC)是一種普遍存在于藍藻和螺旋藻細胞內的捕光色素蛋白，具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗病毒等多種生物學功能，有重要的開發利用價值［3］。現今研究已發現，無論是光動力學方向還是體內外直接作用于腫瘤細胞株，藻藍蛋白在抗腫瘤方面都有著極佳的前景。但目前有關藻藍蛋白抗腫瘤免疫活性作用的分子作用機制尚未明確，關于藻藍蛋白和喉癌的關系至今沒有比較系統的文獻報道。為此本課題選用人喉癌HEP-2細胞進行實驗，通過MTT法觀察藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞活力的影響，采用普通倒置顯微鏡、電鏡、流式細胞術觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響，利用RT-PCR、Western blot等進一步從細胞分子水平深入探討藻藍蛋白的抗腫瘤作用機制，為今后應用藻藍蛋白治療惡性腫瘤奠定一定基礎。

材料和方法

1 細胞和主要試劑

人喉癌HEP-2細胞購于中科院上海細胞庫。藻藍蛋白純度(A620/A280)達4.24，由本實驗室從新鮮鈍頂螺旋藻中提取純化制得。1640培養基、胰酶為Gibco產品;胎牛血清為杭州四季青生物科技有限公司生產;MTT和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產品;Annexin V/PI染色試劑盒為聯科生物產品;RT-PCR及PCR相關試劑為TaKaRa產品;N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、caspase-3、-8、-9 活性檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、PMSF、鼠單克隆抗體cleaved caspase-3、鼠單克隆抗體P53、鼠單克隆抗體β-actin、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG抗體及ECL發光試劑盒均為上海碧云天公司產品。

2 主要方法

2.1 細胞培養 人喉癌HEP-2細胞株在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的1640培養液中生長，并置于37℃、5%CO2的相對飽和濕度孵箱中培養，細胞呈貼壁生長，取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 MTT法檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞生長的影響 取對數生長期的HEP-2細胞，胰酶消化，細胞計數板計數并調整細胞懸液濃度達到1.0×108/L，每孔加入100 μL細胞懸液于96孔細胞培養板中，37℃、5%CO2過夜培養至細胞完全貼壁。加入不同濃度的藻藍蛋白培養液(終濃度為 10、20、40、80、160、320 mg/L)，每個濃度做5個復孔，并設順鉑陽性對照和不含藻藍蛋白的陰性對照。分別以不同的時間梯度進行培養后，加入MTT溶液，繼續孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，避光振蕩10 min。用酶標儀于490 nm處測各孔吸光度值(A)。統計數據后計算各不同濃度藥物對細胞抑制率(R)和半效抑制濃度(IC50)。R=［(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值］×100%。

2.3 倒置顯微鏡下觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞形態的影響 生長狀況較好的HEP-2細胞消化制備細胞懸液，濃度達到1.0×108/L，接種1.5 mL細胞懸液于裝有蓋玻片的6孔板中。待細胞貼壁后，加入藻藍蛋白(0、20、40、80、160、320 mg/L)分別干預人HEP-2細胞24 h和48 h，倒置顯微鏡下觀察HEP-2細胞形態變化并拍照。

2.4 掃描電子顯微鏡觀察細胞的表面結構 在6孔板中分別放入已處理的蓋玻片，每孔加入濃度為1.0×108/L的細胞懸液1.5 mL。培養24 h后根據實驗分組加藥處理，藻藍蛋白終濃度分別為 0、80、160、320 mg/L。處理48 h后將細胞爬片放入4%戊二醛固定液中4℃固定過夜，次日取出經 PBS緩沖液清洗3次，自然晾干，1%鋨酸固定，乙醇梯度脫水，叔丁醇梯度置換，真空干燥，離子濺射鍍膜，放于掃描電鏡中觀察細胞表面結構的變化并拍照保存［4］。

2.5 透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結構 收集經0、80、160、320 mg/L藻藍蛋白作用 48 h的HEP-2細胞及未經處理的 HEP-2細胞，1 500 r/min 4℃離心5 min，PBS洗2次。沉淀經2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構并拍照［5］。

2.6 流式細胞術檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響 不同濃度藻藍蛋白(0、20、40、80、160、320 mg/L)處理HEP-2細胞48 h后，1 000 r/min離心5 min，去上清，用 400 μL PBS 重懸洗滌 2 次，Annexin V-FITC/PI雙熒光(FITC 10 mg/L，PI 50 mg/L)避光染色10 min，將樣本放入流式細胞儀的樣品室內，激發波長488 nm，使用BDFACSDivaTm軟件收集數據，并用ModfitLT 3.0軟件進行細胞凋亡分析［6］。

2.7 細胞內ROS的檢測 HEP-2細胞傳代培養24 h后，按實驗需要用不同濃度藻藍蛋白單用及與ROS抑制劑NAC(3 mmol/L)聯合處理48 h。收集細胞后懸浮于用無血清培養液稀釋好的DCFA-DA(終濃度為10 μmol/L)中，37℃避光孵育20 min，用無血清培養液清洗3次，流式細胞儀測定熒光強度(激發波長488 nm，發射波長525 nm)。實驗重復3次，所得數據經 Quest軟件收集、分析［7］。

2.8 Caspase活性的測定 Caspase-3、-8、-9活性的檢測采用比色法。收集經0、80、160、320 mg/L藻藍蛋白處理24 h的HEP-2細胞，用細胞裂解液在冰上裂解20 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取 10 μL上清進行蛋白定量，于紫外分光光度計內測樣本在595 nm下的吸光度值;另10 μL加80 μL檢測緩沖液及10 μL caspase反應底物，混勻，37℃孵育2 h，測定樣本 A405，再計算 caspase 相對活性［8］。

2.9 RT-PCR檢測細胞凋亡調控基因mRNA的表達 收獲經不同濃度藻藍蛋白(0、80、160、320 mg/L)培養48 h的HEP-2細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，所得沉淀用0.1%DEPC水溶解，用Nano Drop 2000型超微量分光光度計檢測 RNA純度及濃度，取A260/280為1.8～2.0者用于RT反應。參照TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒說明進行cDNA合成，反應體系為 20 μL，包括:總 RNA 1 μg，Prime Script RTase 1 μL，10 × Prime Script buffer 3 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，dNTP Mix 1 μL，Random Primer 1 μL，加 RNA free H2O至20 μL。逆轉錄條件為30℃ 10 min，42℃ 45 min，95℃ 5 min，4℃ 30 min。PCR反應體系按照試劑說明配制以β-actin為內參照，所有引物序列詳見表1。反應條件為94℃ 5 min;94℃ 40 s，58℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環;72℃ 10 min。PCR 產物5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應用凝膠圖像分析管理系統進行灰度測量，mRNA的表達水平以每一樣品與其內參照β-actin灰度比值表示，實驗獨立重復 3 次［9］。

表1 用于RT-PCR分析的引物序列Table 1.The primers sequences for RT-PCR analysis

2.10 Western blot檢測細胞凋亡調控蛋白的表達收集前述方法培養并處理的細胞，用200 μL RIPA裂解液和1 μL PMSF 裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，留取上清，用 BCA蛋白試劑盒測蛋白濃度。在 30 μg體積下行 12%SDS-PAGE，后用PVDF膜轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。用1∶1 000比例稀釋Ⅰ抗，4℃孵育過夜。次日用TBST洗3次，每次15 min，按1∶3 000比例稀釋Ⅱ抗，37℃孵育2 h，接著用TBST洗膜，方法同前。最后滴加ECL液，暗室X線壓片曝光，顯影、定影，內參照用β-actin。掃描X光片后，計算機軟件處理，進行密度分析，計算灰度值［10］。

3 統計學處理

用SPSS 15.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MTT法檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞生長的影響

MTT結果顯示160 mg/L的藻藍蛋白作用12 h后，細胞的生長抑制率為2.83%，作用時間延長至72 h后，抑制率上升至61.85%，與不含藻藍蛋白的對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.05)。這說明藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞有明顯的抑制作用。

并且，藻藍蛋白對HEP-2細胞的抑制率增加，呈劑量依賴性。同時，48 h作用組與24 h作用組不同濃度下的抑制率之間有明顯差別(P＜0.05)，說明藻藍蛋白對喉癌HEP-2細胞生長的抑制作用呈時間依賴性。其24 h的IC50為431.86 mg/L，48 h的IC50為225.93 mg/L，見圖 1。

Figure 1.The inhibitory effect of phycocyanin on HEP-2 cell activity.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 12 h.圖1 藻藍蛋白對HEP-2細胞增殖的抑制作用

2 藻藍蛋白對人喉癌HEP-2細胞形態學影響

在倒置顯微鏡下觀察，對照組HEP-2細胞輪廓清晰，呈梭形、多邊形、上皮細胞樣，良好的貼壁生長，隨著培養時間的增長，細胞逐漸融合成片，在培養基中未見明顯懸浮細胞。隨著藻藍蛋白刺激濃度的增加，貼壁生長細胞逐漸減少，細胞間的連接減少，胞漿濃縮，邊緣不規則，變圓細胞和脫壁漂浮的小圓球細胞逐漸增多，到高濃度藻藍蛋白作用后(320 mg/L)貼壁生長細胞極少。由此可見，隨著藻藍蛋白處理時間的延長，鏡下出現形態學改變的細胞逐漸增多，見圖2。

Figure 2.The morphology of HEP-2 cells treated with phycocyanin for 48 h(×20).圖2 顯微鏡下觀察藻藍蛋白作用48 h后HEP-2細胞的形態

3 掃描電鏡觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞表面形貌結構的影響

對照組HEP-2細胞表面存在著豐富的微絨毛，在細胞邊緣有豐富的絲狀偽足，多且較長，呈放射狀向四周伸展。80 mg/L的藻藍蛋白作用后，部分細胞偽足回縮，多數細胞表面無明顯變化。160 mg/L的藻藍蛋白作用后，HEP-2細胞整體形態與對照組相比差別較為明顯，細胞表面微絨毛和偽足進一步減少或全部消失，細胞變得相對光滑，出現凋亡小體。隨著藥物濃度的繼續增加，細胞形態的改變愈加明顯，大多數細胞凹陷、變形、破損，表面呈空洞化或出現由峭狀、片層狀突起組成的結構，有的細胞極度受損變形成為團塊狀細胞碎片或殘片，見圖3。

4 透射電鏡觀察藻藍蛋白對HEP-2細胞內部超微結構的影響

對照組HEP-2細胞形態規則，表面有豐富的微絨毛，核規則，核仁清晰，靠近核膜一側的胞漿豐富，電子密度低，線粒體結構完整，并可見內質網及游離核糖體。隨著藻藍蛋白作用濃度的升高，各組HEP-2細胞形態變化明顯，細胞體積縮小，形態變得不規則，細胞器結構不清，細胞質中空泡增多，細胞核內異染色質增多，凝集成塊狀或聚集在核膜下，呈分葉狀、花瓣狀，核仁增大，數目增多，形態和位置不規則，大劑量組(320 mg/L PC)細胞膜碎裂，胞漿脫落，核膜消失，細胞核裂解為碎塊，見圖3。

5 喉癌HEP-2細胞凋亡的流式細胞檢測結果

Figure 3.Ultrastructural changes of HEP-2 cells treated with phycocyanin.圖3 電鏡觀察藻藍蛋白作用48 h后HEP-2細胞的超微結構

藻藍蛋白作用HEP-2細胞48 h，與對照組相比，隨著藻藍蛋白給藥劑量的不斷增加，早期及晚期凋亡細胞所占比例逐漸增加，總凋亡率逐漸增加。藻藍蛋白濃度分別為20、40、80、160、320mg/L時，凋亡細胞占細胞總數的百分比分別為11.6%，14.6%，17.3%，18.9%，32.1%。各濃度組凋亡細胞比率與對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。說明藻藍蛋白在20 mg/L～320 mg/L濃度范圍內呈濃度依賴性誘導喉癌HEP-2細胞發生凋亡，見圖4。

6 藻藍蛋白對HEP-2細胞內ROS水平的影響

隨著藻藍蛋白濃度的增加，PC組和PC+NAC組ROS熒光強度也隨之增強(P＜0.01)，單獨使用NAC處理的HEP-2細胞熒光強度無明顯變化。經320 mg/L藻藍蛋白處理的HEP-2細胞內熒光強度為對照組的3.2倍(P＜0.01);而當藻藍蛋白聯合ROS抑制劑NAC處理HEP-2細胞時，細胞內熒光強度雖比PC組低(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)，說明藻藍蛋白處理HEP-2細胞后能使細胞內ROS水平明顯升高，且細胞內ROS水平的升高可被ROS抑制劑抑制，見圖5。

7 Caspase活性測定

不同濃度藻藍蛋白處理HEP-2細胞后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性明顯升高且具有濃度依賴性(P＜0.05)，見表2，表明藻藍蛋白誘導的細胞凋亡是caspase依賴型的。

8 RT-PCR檢測結果

經不同濃度藻藍蛋白作用48 h后，HEP-2細胞Bax、P53、Fas、caspase-3 和 caspase-9 的 mRNA 表達出現上調，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達出現下調，并表現出一定的劑量依賴性。320 mg/L的藻藍蛋白處理組與對照組相比，Bax、Fas、P53、caspase-3和caspase-9 mRNA的表達分別增加了1.6倍、1.8倍、1.9倍、2.6倍和1.7倍，Bcl-2的表達降低了0.6倍，和空白對照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

9 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達

在本實驗中，采用了Western blot方法檢測各組細胞P53和caspase-3蛋白水平的改變。結果顯示不同濃度的藻藍蛋白(80、160、320 mg/L)給藥后，HEP-2細胞P53蛋白 和caspase-3的活化片段(17 kD)逐漸增多，和空白對照組比較差異顯著(P＜0.05)，與RT-PCR和caspase活性檢測結果是一致的，見圖7。

討 論

藻藍蛋白是從螺旋藻中提取的一種捕光色素蛋白，捕光效能高，屬于藻膽蛋白的一種，主要由α和β兩種亞基組成，天然狀態下多以多聚體形式存在。近年來在海洋生物中尋找高效、低毒、不良反應小的抗腫瘤藥物受到越來越多的關注［11］。本實驗結果顯示藻藍蛋白能夠抑制HEP-2細胞增殖并誘導細胞凋亡，且有一定劑量效應關系。

Figure 4.The effects of phycocyanin on apoptosis of HEP-2 cells.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖4 不同濃度藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡的影響

Figure 5.The effects of phycocyanin on ROS production in HEP-2 cells.NAC:N-acetylcysteine.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0.05 vs PC.圖5 不同濃度藻藍蛋白對HEP-2細胞內ROS水平的影響

細胞凋亡的發生是一個級聯式基因表達的結果，主要通過3條信號轉導途徑產生:線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網信號途徑。而3條信號途徑最終都通過引發凋亡中心環節caspase-3的激活，形成級聯反應，進而誘導細胞產生凋亡。Caspase家族在凋亡信號轉導過程中發揮著重要作用，其中caspase-8和caspase-9為凋亡的效應分子，分別與凋亡的死亡受體通路和線粒體通路相關;而caspase-3為關鍵的凋亡執行分子，它在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能。本文進一步檢測了藻藍蛋白處理后HEP-2細胞中caspase的活性，結果發現caspase-3、-8、-9均被激活，說明藻藍蛋白不僅能夠介導細胞凋亡的線粒體通路的活化，而且能夠活化死亡受體通路。

表2 不同濃度藻藍蛋白作用于HEP-2細胞后caspase活性的變化Table 2.The results of caspase activities in the HEP-2 cells treated with phycocyanin at different concentrations(Mean±SD.n=3)

Figure 6.The effects of phycocyanin on the mRNA expression of apoptosis-related genes in HEP-2 cells tested by RT-PCR.β-actin was used as an internal control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖6 RT-PCR檢測藻藍蛋白對HEP-2細胞凋亡調控基因mRNA表達的影響

Figure 7.The effects of phycocyanin on the protein levels of P53 and cleaved caspase-3 determined by Western blot.βactin was used as an internal control.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L.圖7 Western blot檢測藻藍蛋白對 HEP-2細胞 P53和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2和Bax蛋白是線粒體完整性的關鍵調節者，Bcl-2與Bax可形成異源二聚體或與自身形成同源二聚體，參與調節細胞線粒體凋亡途徑。14-噻吩基次亞甲基苦參堿對人鼻咽癌CNE細胞的誘導凋亡機制與激活線粒體凋亡通路(上調 Bax的表達并下調 Bcl-2的表達)有關［12］。Subhashini等［13］研究表明C-PC通過細胞色素C從線粒體釋放進入細胞質，引起Bcl-2的下調從而誘導K562細胞凋亡。我們在研究中發現，藻藍蛋白作用于HEP-2細胞后，Bcl-2表達下降，Bax、caspase-9和caspase-3表達增加，并表現出一定的劑量依賴性，藻藍蛋白可能通過抑制Bcl-2，激活Bax而釋放細胞色素C，釋放到細胞質中的細胞色素C通過形成凋亡小體而啟動caspase依賴的線粒體途徑的細胞凋亡。

Fas/FasL介導的通路也是引起細胞凋亡的重要途徑之一，Fas/Apol屬于腫瘤壞死因子受體超家族，是細胞膜上的糖基化穿膜蛋白。Fas和FasL均主要以膜形式存在，二者結合可引起多種細胞的凋亡。研究發現許多腫瘤細胞具有較高水平FasL表達，而Fas則表達明顯下降，在發生轉移的腫瘤 Fas幾乎完全消失［14］。在本研究中藻藍蛋白可明顯上調HEP-2細胞Fas的表達水平。因而可推測藻藍蛋白誘導HEP-2細胞凋亡可能是通過上調細胞膜表面的 Fas抗原表達，進而激活caspase啟動HEP-2細胞內的凋亡信號轉導通路，誘導細胞凋亡，這與李冰等［8］的研究結果一致。

ROS是生物體內重要的信號分子并對生物生長發育有重要意義。正常情況下，細胞內ROS處于一個相對穩定的水平，但理化和生物因素的刺激可導致細胞內ROS大量增加［7］。ROS與線粒體、死亡受體介導的細胞凋亡均有關聯，且在藥物作用下誘導細胞凋亡的作用更為明顯。本研究發現藻藍蛋白處理HEP-2細胞后能使細胞內ROS水平明顯升高，且細胞內ROS水平的升高可被ROS抑制劑NAC抑制，說明細胞內ROS升高在藻藍蛋白誘導細胞凋亡中起著非常重要的作用，藻藍蛋白可打破細胞內氧化還原平衡，引發細胞內ROS升高，而后者可能作為活化信號，激活細胞凋亡途徑，從而促進細胞凋亡。這與Bobbili等［15］認為自由基消除劑能夠抑制藻藍蛋白介導的AK-5腫瘤細胞的凋亡的結論相符。

另外，p53是細胞內重要的抑癌基因，在本實驗中，RT-PCR和Western blot檢測結果顯示給藥后細胞P53表達增加，且呈現明顯的劑量依賴性，其效果與Ad-ING4-OSM聯合放療抑制喉癌HEP-2細胞生長［16］、槐定堿聯合順鉑誘導人宮頸腺癌HeLa細胞凋亡［17］相當。藻藍蛋白誘導HEP-2細胞凋亡可能是通過P53介導的凋亡途徑，但有關P53蛋白與凋亡發生的具體機制尚有待于進一步的研究。

綜上所述，藻藍蛋白誘導HEP-2細胞凋亡是線粒體途徑和死亡受體途徑激活同時參與的結果。這反映了藻藍蛋白多層次、多靶點的作用優勢。當然，藻藍蛋白對于腫瘤細胞的抑制作用是一個很復雜的問題，本實驗僅從對于腫瘤細胞的增殖和凋亡的影響做了一些探索，可能還有其它方面的因素參與其中，還有待深入研究。

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