miR-363下調(diào)HepG2細胞Mcl-1蛋白的表達并誘導其凋亡

胡建軍，鄭華榮，鄭耀紅(常山縣人民醫(yī)院檢驗科，浙江衢州　324200)

miR-363下調(diào)HepG2細胞Mcl-1蛋白的表達并誘導其凋亡

胡建軍△，鄭華榮，鄭耀紅
(常山縣人民醫(yī)院檢驗科，浙江衢州324200)

［摘要］目的:探討微小RNA-363( microRNA-363，miR-363)的作用靶點及其對HepG2細胞的抑制作用。方法:通過生物信息學分析預測Mcl-1基因是否受microRNA調(diào)控。實時熒光定量PCR檢測正常肝細胞系LO2及肝癌細胞系HepG2、Huh7、PLC的miR-363和Mcl-1的表達水平。將miR-363轉染人HepG2細胞，檢測miR-363對Mcl-1表達水平的影響。MTT法檢測HepG2細胞在轉染miR-363后的相對細胞活力，Annexin V/PI染色法檢測miR-363轉染對HepG2細胞凋亡的影響。結果: Mcl-1 mRNA 3’-非翻譯區(qū)( 3’-UTR)存在miR-363的假定結合位點，在肝癌細胞中轉染miR-363后Mcl-1的表達下降。轉染miR-363可抑制HepG2細胞的活力并誘導其發(fā)生凋亡。結論: miR-363過表達可顯著抑制HepG2細胞的活力并誘導其發(fā)生凋亡，其機制可能與miR-363能下調(diào)HepG2細胞Mcl-1蛋白的表達有關。

［關鍵詞］微小RNA-363; Mcl-1; HepG2細胞;細胞凋亡

肝細胞癌( hepatocellular carcinoma，HCC)是危害人類健康的世界性難題，其預后差，生存時間較短，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位［1］。然而，肝細胞肝癌的發(fā)病機制至今仍不十分清楚，一些細胞保護性蛋白的高度表達可能是HCC發(fā)病的重要原因［2］。Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員，包含3個BH位點，通過與促凋亡蛋白Noxa、puma、bim、bid等的結合使之失活而發(fā)揮抗凋亡效應［3］。有文獻報道腫瘤細胞利用Mcl-1的高度表達逃避細胞的程序性死亡，這也成為了腫瘤細胞對一些化療藥物耐藥的重要機制［4-5］。MicroRNA是近年來備受關注的一類細胞內(nèi)源性的、非編碼的小分子RNA，通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)( 3’-UTR)不完全互補結合，調(diào)節(jié)靶基因在轉錄后的蛋白表達水平［6-7］。近些年來的研究還表明，microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，腫瘤的發(fā)生往往伴隨著細胞內(nèi)miRNA表達的失衡。有文獻報道［8-9］微小RNA-363( microRNA-363，miR-363)在多種腫瘤細胞中表達失調(diào)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移等密切相關，然而miR-363對肝癌的生物效應卻很少報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-363靶向于Mcl-1 mRNA的3’-UTR區(qū)，轉染miR-363模擬物能抑制肝癌細胞的生長并促進其凋亡。

材料和方法

1實驗材料

人肝癌細胞株HepG2、Huh7、PLC和人正常肝細胞系LO2購于上海生科院細胞庫，細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)并通入5% CO2。RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco;胎牛血清( FBS)購于杭州四季青生物工程有限公司; miR-363模擬物序列為5’-AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA-3’、對照RNA( control RNA)序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’，購自廣州銳博生物;噻唑藍( MTT)、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于Sigma;細胞裂解液、兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin購于CST; Lipofectamine 2000、TRIzol購于Invitrogen;逆轉錄試劑盒、SYBR Green購于TaKaRa; ECL顯色試劑盒購自Pierce。

2主要方法

2.1Real-time PCR檢測HCC細胞及LO2細胞miR-363和Mcl-1的表達水平將5×105個HepG2細胞接種于6孔板中進行培養(yǎng)，待細胞鋪滿培養(yǎng)板80%時，將miR-363(每孔100 pmol)或對照RNA(每孔100 pmol)通過Lipofectamine 2000按試劑說明書要求轉入HepG2細胞培養(yǎng)24 h，對照組不做任何處理培養(yǎng)24 h，收集細胞，進行real-time PCR。總RNA 用TRIzol試劑提取，miR-363采用特異性莖環(huán)引物法［10］進行miR-363的逆轉錄，Mcl-1直接用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉成cDNA，操作步驟照試劑盒說明書進行。逆轉錄產(chǎn)物用SYBR Green試劑按照說明書進行處理并在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System上進行PCR擴增，Mcl-1基因以GAPDH的mRNA作為內(nèi)參照，miR-363以U6 small nuclear RNA( snRNA U6)作為內(nèi)參照，用2－ΔΔCt法分析Mcl-1和miR-363的相對表達［11］。PCR引物序列見表1。

2.2Western blot檢測HCC細胞或LO2細胞Mcl-1的表達水平收集細胞，將細胞裂解后將蛋白提取液行12.5%SDS-PAGE，之后將蛋白轉膜到PVDF膜( Millipore)上。將膜在兔抗人Mcl-1或兔抗人β-actin I抗稀釋液中孵育過夜，之后再在帶HRP酶活性的羊抗兔IgG II抗稀釋液中孵育2 h，ECL試劑顯色曝光。

表1　PCR引物序列Table 1.The sequence of PCR primers

2.3MTT法檢測細胞活力將HepG2細胞接種于96孔板中培養(yǎng)16 h，按操作說明書將miR-363(每孔5 pmol)或對照RNA(每孔5 pmol)用Lipofectamine 2000轉入HepG2細胞，培養(yǎng)24 h，對照組不做任何處理培養(yǎng)24 h，之后加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，往孔中加150 μL DMSO，振蕩使紫色絮狀物完全溶解，570 nm波長下用酶標儀檢測吸光度( A)值，細胞的活力以A570表示。

2.4細胞凋亡檢測將HepG2細胞接種于6孔板中培養(yǎng)16 h，按操作說明書將miR-363(每孔100 pmol)或control RNA (每孔100 pmol)用Lipofectamine 2000轉入HepG2細胞，培養(yǎng)24 h，對照組不做任何處理培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照試劑說明書將PI和Annexin V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡。

2.5生物信息學預測miR-363靶基因對miR-363靶基因的預測采用Target Scan Human 6.2在線工具( http: / /www.targetscan.org/)，若靶基因的3’UTR存在能與miR-363發(fā)生非完美互補配對的序列(至少有6對堿基連續(xù)互補配對)，則該基因視為miR-363的潛在靶基因。

3統(tǒng)計學處理

所有實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差( mean±SD)表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS 13.0進行分析，2組間數(shù)據(jù)差異用雙側t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 肝癌細胞高表達Mcl-1

為了明確Mcl-1是否在肝癌細胞中高表達，我們用real-time PCR和Western blot方法檢測人正常肝細胞系LO2及人肝癌細胞系HepG2、Huh7和PLC的Mcl-1表達水平，結果表明3種肝癌細胞系相比于LO2細胞Mcl-1的表達，不論mRNA水平還是蛋白水平均顯著上升，見圖1。

Figure 1.The expression of Mcl-1 at mRNA and protein levels in HCC cells and LO2 cells.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05 vs LO2 cells.圖1　HCC細胞Mcl-1的mRNA及蛋白表達水平相比于正常肝細胞顯著升高

2 HCC細胞Mcl-1受miR-363調(diào)控

為了研究HCC細胞中Mcl-1是否受microRNA調(diào)控，我們嘗試通過TargetScan工具預測Mcl-1的調(diào)控microRNA，結果發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA 3’-UTR確實存在miR-363的作用靶點( GUGCAAU，3’-UTR的第12 ～18個堿基)，見圖2。因此我們用熒光定量PCR法檢測HCC細胞和LO2細胞miR-363的表達水平，發(fā)現(xiàn)HCC細胞相比于LO2細胞miR-363表達水平減少，這些結果提示Mcl-1表達可能和miR-363存在反比關系，見圖3。為了進一步明確miR-363調(diào)控Mcl-1的表達水平，我們將miR-363相對表達水平最低的HepG2細胞作為研究對象，用real-time PCR方法檢測miR-363的轉染效率和Mcl-1的表達，結果發(fā)現(xiàn)miR-363轉染后，HepG2細胞的miR-363表達水平相比于轉染對照RNA提高了10.245倍，而轉染miR-363模擬物相比于轉染對照RNA可顯著降低Mcl-1 mRNA及蛋白表達水平，表明miR-363確實能下調(diào)Mcl-1的水平，見圖4。

Figure 2.The putative miR-363 binding site in 3’-UTR of Mcl-1 gene.圖2　Mcl-1 3’-UTR存在miR-363的結合位點

Figure 3.The expression of miR-363 in HCC cells and LO2 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs LO2 cells.圖3　HCC細胞miR-363的表達水平相比于正常肝LO2細胞顯著降低

Figure 4.The exogenous miR-363 significantly increased the expression of miR-363 and decreased the levels of Mcl-1 in HepG2 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control RNA group.圖4　miR-363轉染顯著提高HepG2細胞miR-363表達水平并降低細胞內(nèi)Mcl-1的表達水平

3 miR-363抑制HepG2細胞的細胞活力并誘導細胞凋亡

為了研究miR-363對HepG2細胞活力的抑制作用，我們用MTT法檢測HepG2細胞在miR-363治療下的增殖情況，結果發(fā)現(xiàn)miR-363組相比于對照RNA組，細胞活力顯著降低，見圖5。Mcl-1為抗凋亡蛋白，因此我們用流式細胞術檢測miR-363是否通過誘導HepG2的凋亡來抑制HepG2細胞的活力，結果發(fā)現(xiàn)miR-363組相比于control RNA組，細胞凋亡水平提高，見圖6。這些結果提示了miR-363通過下調(diào)Mcl-1的表達抑制肝癌細胞生長并誘導其發(fā)生凋亡。

Figure 5.miR-363 decreased the cell activity of HepG2 cells.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs control RNA group.圖5　miR-363顯著抑制HepG2的細胞活力

Figure 6.miR-363 induced apoptosis of HepG2.圖6　miR-363誘導HepG2細胞凋亡

討論

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中關鍵的抗凋亡蛋白，Mcl-1在人類各種腫瘤細胞系中均高度表達。Sieghart等［12］發(fā)現(xiàn)149個肝細胞肝癌患者中有51%的患者的肝腫瘤組織中高度表達Mcl-1，而腫瘤組織附近的正常肝組織Mcl-1的表達量卻很低，表明Mcl-1的過表達是腫瘤特異性改變之一。將腫瘤細胞的Mcl-1基因沉默后會引起腫瘤細胞凋亡，但不影響正常肝細胞的生物學性狀［13-14］。Mcl-1對其它類型的腫瘤也起著十分重要的作用，Thallinger等［15］發(fā)現(xiàn)在患有黑色素瘤的重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠的皮下腫瘤組織中注射Mcl-1的反義寡核苷酸可以增加腫瘤細胞對化療藥物達卡巴嗪的敏感性，并且使腫瘤細胞的凋亡程度增加。這些研究都提示了Mcl-1可以作為腫瘤治療的一個重要靶點。

MicroRNAs是一種生物效應很強的小分子核酸，在細胞中通過調(diào)節(jié)對應基因的表達參與細胞各項生理活動。研究表明microRNAs表達的改變往往會導致腫瘤的發(fā)生［16］，一些特定的microRNAs還被用作腫瘤診斷及預后的評價指標［17］。miR-363是一個細胞中有廣泛生物學效應的microRNA，近期的研究還發(fā)現(xiàn)miR-363在多種腫瘤組織表達失調(diào)。Ng等［18］的研究表明miR-363在NK/T細胞淋巴瘤中起腫瘤抑制作用。此外，miR-363在高轉移性頭頸部鱗狀細胞癌中同樣表達下調(diào)［19］。

我們在本研究中證實了miR-363的表達在3種肝腫瘤細胞系中相比于正常肝細胞系均顯著下降，而Mcl-1基因在肝癌細胞中相比于正常肝細胞系表達顯著升高，兩者存在反比關系，提示miR-363在肝癌細胞中起腫瘤抑制作用，而Mcl-1則可能對腫瘤發(fā)展有促進作用。我們在進一步的實驗中發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中轉染miR-363相比于轉染對照RNA可顯著抑制其細胞活力。為了研究其機制，我們通過生物信息學方法尋找miR-363的潛在靶基因，結果發(fā)現(xiàn)Mcl-1可能受miR-363的調(diào)控。為了驗證這一假設，我們將miR-363轉染HepG2細胞后，檢測細胞內(nèi)Mcl-1的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)miR-363的轉染確實能引起Mcl-1的下調(diào)，表明Mcl-1為miR-363的靶基因。Mcl-1已經(jīng)被證實屬于Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，因此我們推測miR-363抑制HepG2細胞活力的機制可能和細胞凋亡有關。為了驗證這一假設，我們通過流式細胞術檢測HepG2細胞在轉染miR-363后細胞的凋亡程度，結果證實了miR-363確實能誘導HepG2的凋亡。結合這些實驗結果，我們的研究表明miR-363為一腫瘤抑制性miRNA，其過表達能顯著抑制肝腫瘤細胞的細胞活力，其機制為miR-363下調(diào)腫瘤細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Mcl-1的表達水平，進而誘導細胞發(fā)生凋亡。本研究的意義在于提示了miR-363-Mcl-1途徑可能成為一個新的治療肝細胞肝癌的重要靶點。

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·綜述·

miR-363 downregulates Mcl-1 expression and induces apoptosis in HepG2 cells

HU Jian-jun，ZHENG Hua-rong，ZHENG Yao-hong
( Changshan People’s Hospital，Quzhou 324200，China.E-mail: changshanhujianjun@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To determine the effect of microRNA-363( miR-363) on HepG2 cells.METHODS: Bioinformatic analysis was conducted to identify if the Mcl-1 was regulated by miR-363.The expression of Mcl-1 and miR-363 was detected by real-time PCR in normal liver cell line LO2 and hepatocellular carcinoma cell line HepG2，Huh7 and PLC.miR-363 was transfected into the HepG2 cells，and then the level of Mcl-1 was measured.The relative viability was evaluated by MTT assay after the HepG2 cells were transfected with miR-363，and the apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI staining.RESULTS: Bioinformatic analysis identified that there was a putative target site in the Mcl-1 mRNA for miR-363.Transfection of miR-363 mimics suppressed Mcl-1 expression in the HepG2 cells.Transfection of miR-363 mimics inhibited the cell viability as well as inducing cell apoptosis in HepG2 cells.CONCLUSION: Over-expression of miR-363 significantly inhibits the cell viability and induces apoptosis in HepG2 cells，and the mechanism may be related to the downregulation of Mcl-1 caused by miR-363 transfection.

［KEY WORDS］MicroRNA-363; Mcl-1; HepG2 cells; Apoptosis

通訊作者△Tel: 0570-5039003; E-mail: changshanhujianjun@163.com

［收稿日期］2014-12-10［修回日期］2015-01-31

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1329-05

［中圖分類號］R735. 7; R730. 23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.032