脂聯素通過激活PP2A減輕H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷及tau蛋白過度磷酸化*

宋哲，薛超，張小曼，張葉敏，何小華，尹君

(武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430071)

脂聯素通過激活PP2A減輕H2O2誘導的SH-SY5Y細胞損傷及tau蛋白過度磷酸化*

宋哲，薛超，張小曼，張葉敏，何小華△，尹君△

(武漢大學基礎醫學院，湖北 武漢 430071)

目的:觀察脂聯素(adiponectin)對H2O2誘導的人神經母細胞瘤SH－SY5Y細胞活力及tau蛋白磷酸化的影響并探討其作用機制。方法:采用MTT法并觀察細胞形態，檢測脂聯素對H2O2誘導的SH－SY5Y細胞活力損傷的影響;應用Western blotting觀察脂聯素對tau蛋白磷酸化及蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)和糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)活性的影響。結果:脂聯素減輕了H2O2誘導的SH－SY5Y細胞損傷(P＜0.01)。脂聯素上調了H2O2誘導的SH－SY5Y細胞的PP2A活性，明顯減輕此時tau的異常過度磷酸化(P＜0.01)。PP2A抑制劑岡田酸阻斷了脂聯素的保護作用(P＜0.01)。脂聯素同時使H2O2誘導的SH－SY5Y細胞的GSK－3β磷酸化水平上升(P＜0.01)。結論:脂聯素減輕H2O2誘導的SH－SY5Y細胞損傷及tau蛋白異常過度磷酸化，其機制可能與激活PP2A并抑制GSK－3β信號途徑有關。

脂聯素;過氧化氫;蛋白磷酸酶2A;糖原合酶激酶－3β;Tau蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的中樞神經系統退行性疾病之一，主要表現為進行性記憶喪失和認知障礙［1］。AD的主要病理學特征為患者腦內神經原纖維纏結(neurofibrilary tangle，NFT)、大量老年斑(senile plaque，SP)和神經元丟失等。NFT位于神經細胞內，由異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau相互纏結形成。Tau異常過度磷酸化的機制并不完全清楚，相當多證據表明可能與腦部蛋白激酶(protein kinases，PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PPs)的活性改變有關［2］，其中較為重要的有糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)。AD患者腦中GSK－3β活性增強［3］，以及PP2A活性抑制［4］可使tau蛋白的磷酸化水平顯著升高［5］，促進AD的發生。

脂聯素(adiponectin，Adipo)是機體重要的細胞因子，主要由脂肪組織分泌，具有抗炎、抗氧化和調節胰島素敏感性等功能［6］。在外周組織中，脂聯素對高血壓、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝和2型糖尿病等有改善作用［6］。脂聯素是胰島素的增敏因子，能夠增加磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的活性［7］，Akt作為GSK－3β的上游激酶，使GSK－3β的Ser9位點磷酸化而活性下降。脂聯素也可以影響PP2A的活性，在乳腺癌細胞中，脂聯素通過AMP活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)途徑激活PP2A從而降低腫瘤的侵襲性［8］。脂聯素在中樞神經系統中具有一定作用，它不僅調節下丘腦攝食中樞［9］，影響中心體溫和能量代謝［10］，還能夠減輕卡因酸誘導的細胞毒性［11］。報道顯示，AD患者往往有內分泌的改變，血漿中脂聯素含量異常［12］，但脂聯素在中樞神經系統中的作用尚不清楚。本文通過觀察脂聯素對H2O2誘導的神經細胞損傷及tau蛋白過度磷酸化的影響，探討了脂聯素對AD的影響及其機制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

脂聯素由美國德克薩斯大學健康科學中心Lily Q.Dong教授惠贈。PP2A、p－GSK－3β(Ser9)和p－tau (Ser396)抗體購于Cell Signaling;GSK－3β抗體購于Signalway Antibody LLC;p－tau(Ser404)抗體購于Santa Cruz;tau－5、p－PP2A(Tyr307)和β－actin抗體購于Abcam;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的Ⅱ抗、增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購于Pierce;DMEM細胞培養液和胎牛血清購自Hyclone;MTT粉劑(Biosharp);H2O2溶液(國藥集團);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于上海申工，其它試劑購于Sigma。

Western blotting設備(Bio－Rad);SW－CJ系列超凈工作臺(江蘇安泰空氣技術有限公司);CO2培養箱(Forma);倒置顯微鏡(Nikon);多功能酶標儀(BioTek)。

2 方法

2.1 SH－SY5Y細胞培養人神經母細胞瘤SHSY5Y細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液內，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養。

2.2 實驗分組為研究H2O2對細胞的損傷作用，給予細胞不同濃度H2O2處理1 h后檢測細胞活力，確定后續實驗中H2O2的濃度。為了研究脂聯素的保護作用，細胞分為對照組、脂聯素組、H2O2組和H2O2+脂聯素組。在H2O2(200 μmol/L)處理40 min后，給予脂聯素(2 mg/L)與H2O2共同作用20 min，進行MTT檢測、細胞形態學觀察及Western blotting檢測。岡田酸(okadaic acid，OA)抑制實驗中，細胞分為H2O2處理組、脂聯素+H2O2組、OA+ H2O2組和脂聯素+OA+H2O2組。細胞給予1 nmol/L OA預處理1 h后，在加入H2O2和脂聯素共同作用。實驗至少重復3次。

2.3 細胞活力的檢測細胞活力采用MTT法進行測定。細胞接種于96孔細胞培養板，接種密度為5×103/L，每孔培養液體積為100 μL，每組設定6個平行孔。細胞培養液中加入不同濃度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2，37℃作用1 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續培養4 h。棄培養液，每孔加入150 μL DMSO，輕搖10 min，多功能酶標儀490 nm波長下測定吸光度(absorbance，A)。

2.4 Western blotting檢測蛋白水平細胞處理結束后用預冷的1×PBS洗2次，6孔板每孔加入含磷酸酶抑制劑的RIPA buffer裂解細胞，12 000×g離心10 min，獲取上清。BCA法測定細胞蛋白濃度后，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST洗膜，I抗4℃孵育過夜。洗膜，加入HRP標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。洗膜后ECL顯色。膠片掃描并用ImageJ圖像分析系統進行灰度分析。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism統計軟件處理。數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較并采用單因素方差分析(one－way ANOVA)及LSD－t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 不同濃度H2O2對SH-SY5Y細胞活力的影響

H2O2誘導了SH－SY5Y細胞的急性損傷。不同濃度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2作用于SH－SY5Y細胞1 h，MTT法測定細胞活力，結果見圖1。在100 μmol/L H2O2處理時，細胞活力有所下降，但沒統計學差異(P＞0.05)。給予更高濃度H2O2處理，細胞活力顯著下降且呈劑量依賴性，200、400和600 μmol/L組的細胞活力分別是對照組的83.9%、47.8%和31.3%，差異有統計學意義(P＜0.01)。因200 μmol/L是使細胞活力下降的最低濃度，所以后續實驗中所用H2O2濃度均為200 μmol/L。

Figure 1.The viability of SH－SY5Y cells incubated with H2O2at different concentrations.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖1 不同濃度H2O2對SH-SY5Y細胞活力的影響

2 脂聯素對H2O2誘導細胞損傷的保護作用

給予SH－SY5Y細胞200 μmol/L H2O2處理40 min后，加入2 mg/L脂聯素與H2O2共同作用20 min，MTT法檢測細胞活力，顯微鏡下觀察細胞形態。與對照組相比，H2O2處理組的細胞活力顯著下降(P＜0.01)。給予脂聯素后，H2O2的損傷作用被抑制，細胞活力由損傷時的81.5%升高到95.8%(P＜0.01)，基本恢復正常。與對照組相比，單獨應用脂聯素對細胞活力沒有明顯影響(P＞0.05)。在100倍顯微鏡下，各組細胞外形完好，突起正常，形狀無明顯差異，見圖2。上述結果說明脂聯素能減輕H2O2誘導的細胞損傷。

3 脂聯素降低H2O2誘導的tau蛋白異常過度磷酸化

SH－SY5Y細胞在H2O2作用下給予脂聯素處理，檢測細胞內tau蛋白的Ser396和Ser404位點磷酸化及總tau蛋白(tau－5)水平的變化，β－actin作為內參照。結果顯示，與對照組相比，H2O2處理組的tau蛋白在Ser396和Ser404位點的磷酸化水平顯著上升(P＜0.01)，給予脂聯素后，tau蛋白的磷酸化水平下降，有統計學差異(P＜0.05)。總tau蛋白在組間無差異，單獨給予脂聯素對tau蛋白的磷酸化水平無明顯影響(P＞0.05)，見圖3。

4 脂聯素對PP2A活性的影響

與對照組相比，H2O2處理組PP2A的Tyr307位點磷酸化(非活性形式)水平明顯增高，導致PP2A活性下降(P＜0.01);給予脂聯素后，PP2A的Tyr307磷酸化水平明顯降低，活性升高(P＜0.01);單獨給予脂聯素時，PP2A的總量及磷酸化水平無明顯改變(P＞0.05)，見圖4。上述結果說明H2O2通過抑制PP2A活性使tau蛋白異常過度磷酸化，而脂聯素可以通過增加PP2A活性減輕H2O2誘導的tau蛋白過度磷酸化。

5 PP2A抑制劑OA對脂聯素保護作用的影響

SH－SY5Y細胞預先給予PP2A抑制劑OA(1 nmol/L)處理1 h，隨后加入H2O2和(或)脂聯素后提取蛋白，檢測tau蛋白的總量和磷酸化水平。結果顯示，與H2O2組相比較，脂聯素+H2O2組的p－tau Ser396顯著降低(P＜0.01)。如預先給予OA，脂聯素降低tau蛋白磷酸化的作用明顯減弱，p－tau Ser396上升(P＜0.01)，且與OA+H2O2組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。上述結果說明脂聯素主要是通過激活PP2A來降低H2O2誘導的tau蛋白過度磷酸化。

Figure 3.The effects of adiponectin(Adipo)on H2O2－induced hyperphosphorylation of tau in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2.圖3 脂聯素降低H2O2誘導的tau蛋白異常過度磷酸化

Figure 4.The effects of adiponectin(Adipo)on PP2A activity in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.圖4 脂聯素對PP2A活性的影響

Figure 5.The effects of PP2A inhibitor OA on the cytoprotective function of adiponectin(Adipo).Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs H2O2;##P＜0.01 vs Adipo+ H2O2.圖5 PP2A抑制劑OA對脂聯素保護作用的影響

6 脂聯素對GSK-3β磷酸化的影響

H2O2組GSK－3β的Ser9位點磷酸化(非活性形式)水平增高，為對照組的119.6%(P＜0.05);繼續給予脂聯素后p－GSK－3β Ser9增加至對照組的175.2%(P＜0.01);單獨給予脂聯素組GSK－3β的磷酸化水平無明顯改變(P＞0.05)，GSK－3β的總量在組間無顯著差異，見圖6。

Figure 6.The effects of adiponectin(Adipo)on the phosphorylation level of GSK－3β in the SH－SY5Y cells.Mean± SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.圖6 脂聯素對GSK-3β磷酸化的影響

討論

AD是老年人最常見的癡呆類型，發病機制不甚明確。目前認為AD由多因素引起，并提出了多種假說，包括異常蛋白聚積學說，Aβ級聯反應學說，氧化應激學說及細胞凋亡學說等。越來越多的資料證明，氧化應激作為可能的觸發因素，與其它機制相互作用。在AD早期，患者出現臨床癥狀之前就存在氧化損傷［13］。氧化應激還參與了AD特征性病理學改變NFT的形成及神經元凋亡［14］。本實驗采用H2O2處理細胞，模擬機體的氧化應激狀態，發現神經細胞出現活力降低及tau異常過度磷酸化的表現，這與其它文獻在人胚腎HEK293/tau細胞上的研究結果類似［15］。

脂聯素作為外周重要的脂肪因子，對體內多條信號途徑有調節作用。脂聯素能夠增加人乳腺癌MDA－MB－231細胞中PP2A的活性，抑制腫瘤的轉移［8］。我們研究發現，SH－SY5Y細胞在H2O2存在的條件下，脂聯素能明顯激活PP2A;在沒有H2O2的條件下，脂聯素對PP2A活性的影響則不明顯。上述表現和乳腺癌細胞中即使無外界刺激脂聯素仍能激活PP2A的表現不甚一致［8］，可能是外周組織細胞與中樞神經細胞對脂聯素反應性不同所造成。PP2A的激活使tau去磷酸化，我們的研究發現，預先給予OA阻斷PP2A時，脂聯素降低tau磷酸化水平的作用消失，說明脂聯素在很大程度上通過PP2A途徑起作用。

Tau蛋白的磷酸化水平也受蛋白激酶調控［16］。其它小組研究發現，在H2O2作用下，HEK293/tau細胞的p－GSK－3β(Ser9)(非活性形式)水平增高，其作者認為此時GSK－3β存在被切割的情況，GSK－3β活性仍然上升［15］。另一研究也發現大鼠原代皮層神經元在H2O2作用下p－GSK－3β(Ser9)水平增高，作者認為是代償反應［17］。我們研究發現，盡管在H2O2作用下SH－SY5Y細胞的p－GSK－3β(Ser9)水平增高，然而此時tau蛋白呈現出過度磷酸化狀態，可以推測此時tau蛋白的過度磷酸化主要由PP2A活性下降引起，而GSK－3β活性是否變化需要進一步研究。脂聯素在H2O2刺激條件下使p－GSK－3β(Ser9)明顯上升，可能是脂聯素激活了PI3K/Akt途徑，這在大鼠心肌細胞上有類似表現［18］。與我們發現的PP2A結果類似，無H2O2存在時脂聯素對GSK－3β活性影響不大，說明脂聯素的保護作用主要體現在機體受損的狀態下，這為AD的防治提供了新思路。

細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)不斷生成和清除，當氧化作用超過了抗氧化作用時，氧化應激就會發生。脂聯素在外周組織中具有抗氧化特性，如在人腎小球系膜細胞中給予脂聯素能降低ROS保護機體［19］。在我們的研究中，脂聯素同樣可能是通過降低ROS來增加細胞活力并減輕tau的過度磷酸化。

總之，本研究證實脂聯素對H2O2誘導的神經細胞損傷及tau蛋白過度磷酸化具有抑制作用，其機制可能與激活PP2A和抑制GSK－3β信號途徑有關。本研究為脂聯素在中樞神經系統疾病尤其是神經退行性疾病的臨床應用提供了新的依據。

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Adiponectin attenuates H2O2-induced SH-SY5Y cell injury and tau hyperphosphorylation via activating PP2A

SONG Zhe，XUE Chao，ZHANG Xiao－man，ZHANG Ye－min，HE Xiao－hua，YIN Jun

(School of Basic Medical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071，China.E-mail:hexiaohua@whu.edu.cn;yinjun@ whu.edu.cn)

AIM:To study the effects of adiponectin on H2O2－induced cell injury and tau hyperphosphorylation in human neuroblastoma SH－SY5Y cells.METHODS:Cell viability was determined by MTT assay.H2O2－induced cell injury and morphological changes in the SH－SY5Y cells with or without adiponectin treatment were observed.The level of tau phosphorylation as well as the activities of protein phosphatase 2A(PP2A)and of glycogen synthase kinase－3β(GSK－3β) were examined by Western blotting.RESULTS:Adiponectin significantly attenuated H2O2－induced cell injury (P＜0.01).Adiponectin upregulated the activity of PP2A and decreased phosphorylation levels of tau under the stimulation with H2O2(P＜0.01).Okadaic acid，a specific inhibitor of PP2A，blocked the protective effects of adiponectin(P＜0.01).Adiponectin increased the phosphorylation level of GSK－3β at Ser9 site under H2O2stimulation(P＜0.01).CONCLUSION:Adiponectin protects SH－SY5Y cells against H2O2－induced cell injury and decreases tau hyperphosphorylation by activating PP2A and inactivating GSK－3β.

Adiponectin;Hydrogen peroxide;Protein phosphatase 2A;Glycogen synthase kinase－3β;Tau proteins

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.003

1000－4718(2015)02－207－06

2014－10－31

2015－01－08

國家自然科學基金資助項目(No.81100594);教育部博士點基金資助項目(No.20100141120057)

△通訊作者何小華Tel:027－68759991;E－mail:hexiaohua@whu.edu.cn;尹君Tel:027－68759846;E－mail:yinjun@whu.edu.cn