Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸鍶促進骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用*

胡潔芬，廖靜秋，張偉杰，許翎，智喜梅，林凱，吳文△

(1南方醫科大學，廣東 廣州 510515;2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東省老年醫學研究所東病區內分泌科，廣東 廣州 510080)

Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸鍶促進骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用*

胡潔芬1，2，廖靜秋1，2，張偉杰2，許翎2，智喜梅2，林凱2，吳文2△

(1南方醫科大學，廣東 廣州 510515;2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院，廣東省老年醫學研究所東病區內分泌科，廣東 廣州 510080)

目的:探討Hedgehog/Gli1信號通路在雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)向成骨細胞分化中的作用。方法:體外分離培養大鼠BMSCs，誘導其成骨分化，根據實驗目的加入不同濃度的Sr、Hedgehog受體拮抗劑cyclopamine(Cy)及Gli1小干擾RNA(Gli1－siRNA)。用Western blotting法檢測Gli1及Runx2的表達，酶標法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色法檢測鈣結節水平。結果:應用不同濃度的Sr (0.1～5 mmol/L)處理BMSCs細胞7 d后，細胞內Gli1蛋白表達增高，Sr的濃度為3 mmol/L時，Gli1表達達到高峰;使用Cy與Sr共處理BMSCs 7 d，能拮抗Sr對Gli1蛋白表達的上調作用;應用Gli1－siRNA轉染細胞后，能下調Gli1蛋白的表達，并抑制Sr對Gli1下游Runx2蛋白表達的上調作用，還可拮抗Sr對ALP活性及鈣化結節形成的促進作用。結論:Hedgehog/Gli1通路參與了Sr促進骨髓間充質干細胞向成骨分化的過程。

雷奈酸鍶;骨髓間充質干細胞;Hedgehog蛋白;Gli1蛋白;Runx2蛋白

雷奈酸鍶(strontium ranelate，Sr)是新一代抗骨質疏松藥物，可同時作用于破骨細胞和成骨細胞，具有抑制骨吸收和促進骨形成的雙重作用。臨床研究證實雷奈酸鍶能顯著提高骨密度，改善骨微結構，降低發生椎體骨折及非椎體骨折的風險［1］。目前，已有一些研究支持Sr可在細胞水平上促進骨形成，例如Choudhary等［2］發現，Sr誘導小鼠的骨髓間質細胞向成骨細胞分化與環氧化酶2和前列腺素E2的介導有關;Peng等［3］發現鍶鹽能夠通過激活Ras/ MAPK信號通路以及下游的轉錄因子Runx2(為成骨分化重要轉錄因子)的活性促進MSCs的成骨分化; Fromigue等［4］認為激活活化T細胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)以及下游Wnt信號通路在Sr促進BMSCs成骨分化中起重要作用。

我們的前期研究發現能夠通過Sr激活轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)/ Smad2［5］、骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP2)/Smad1/5/8［6］、SonicHedgehog (Shh)［7］及下游的轉錄因子Runx2的活性，繼而誘導BMSCs向成骨分化。其中，Hedgehog通路在近年來的研究中受到重視，不少研究表明其在成骨發育過程中起重要作用，對脊椎動物骨骼系統的形成和發育起重要調節作用［8］。然而Hedgehog通路能否通過其下游信號分子Gli在Sr促進BMSCs成骨分化中起作用，目前尚未完全明了。為此，本實驗擬在前文［7］的研究基礎上，進一步觀察Hedgehog/Gli通路在Sr促進BMSCs分化為成骨細胞中的作用。

材料和方法

1 主要材料

4周齡雄性SD大鼠購自中山大學實驗動物中心;DMEM/F12培養基和胎牛血清購自HyClone; 0.25%胰酶和Opti－MEM購自Gibco;地塞米松、β－甘油磷酸鈉和抗壞血酸購自Sigma;Sr干混懸劑由Servier公司惠贈;ALP檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細胞茜素紅(alizarin red)鈣染色試劑盒購自上海杰美生物技術有限公司;Gli1抗體購自Santa Cruz;Runx2抗體購自CST;GAPDH購自上海康成生物有限公司;cyclopamine購自Selleckchem;siRNA購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine 2000 (Lipo2000)購自Invitrogen。

2 主要方法

2.1 大鼠BMSCs的分離、純化及培養取4周齡雄性SD大鼠1只，頸椎脫臼法處死后用75%乙醇浸泡5 min，在無菌條件下分離出兩側股骨和脛骨，剔除周圍的肌肉、筋膜等組織，剪去股骨近端及脛骨遠端，暴露骨髓腔;用含10%胎牛血清的DMEM/ F12培養基反復沖洗骨髓腔，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入5 mL上述培養液重懸細胞，接種于25 cm2的培養瓶中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養;24 h后換液，以后每隔2～3 d換液1次;倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況，直至細胞接近80%～90%融合時進行1∶2傳代純化。

2.2 BMSCs的成骨分化選取第3～5代BMSCs為研究對象，根據不同實驗需要將細胞種植于培養皿或培養板中，待細胞至80%～90%融合后，加入成骨誘導液(含10%胎牛血清、1×10－8mol/L地塞米松、10 mmol/L β－甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸的DMEM/F12培養液)培養。

2.3 ALP活性的檢測選取第3代細胞按1×108/ L密度接種于24孔板，各實驗組給予不同處理因素后，于第7天采用酶標法檢測ALP活性。檢測時將細胞收集后用裂解液充分裂解，裂解后12 000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說明書進行操作，于酶標儀492 nm波長處測定吸光度(A)值。

2.4 茜素紅鈣結節染色選取第3代細胞，接種于預先放置24 mm×24 mm蓋玻片的6孔板中。各實驗組給予不同處理后，于第21天按照細胞茜素紅鈣染色試劑盒說明書對樣本進行固定、染色劑澄清處理，倒置顯微鏡下觀察鈣結節染色情況，每組選3個樣本，每樣本隨機選取1個視野(×100)，比較各組間的差異。

2.5 Western blotting法檢測Gli1和Runx2蛋白的表達選取第3代細胞接種于60 mm培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，用預冷PBS洗2遍，加入細胞裂解液，4℃裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，去上清液，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。總蛋白經SDS－PAGE分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入Gli1抗體(1∶200)和Runx2抗體(1∶1 000)，4℃過夜，用TBST洗3遍，每次5 min，隨后加入Ⅱ抗(1∶4 000)常溫孵育1.5 h，再用TBST洗3遍，每次5 min。用發光試劑ECL將膜顯色，暗室曝光，凝膠成像系統掃描并分析結果。

2.6 RNA干擾技術設計3條Gli1－siRNA及1條陰性siRNA。瞬時離心后，用滅菌ddH2O將siRNA凍干粉配成20 μmol/L儲存液，分裝保存，避免反復凍融。轉染前1 d，接種適當數量的細胞至培養板或皿中，置于37℃、5%CO2培養箱中過夜，使轉染時細胞密度達60%～70%。轉染時先制備siRNALipo2000混合液:先用不含血清培養基Opti－MEM分別稀釋siRNA儲存液、Lipo2000，輕輕混勻，室溫放置5 min后將2種混合液混勻，室溫孵育20 min，將siRNA－Lipo2000混合液加入不含雙抗的細胞培養基中，混勻。6 h后棄去混合液，更換新鮮培養基，進行加藥處理。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0統計學軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)檢驗，兩兩比較采用LSD－t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 Sr上調BMSCs的Gli1表達

圖1A顯示，不同濃度Sr(0.1、1、3和5 mmol/L)處理BMSCs 7 d后，Gli1表達均顯著高于對照組(P＜0.01)，且在3 mmol/L Sr時，Gli1表達水平達最高值，呈現一定的濃度依賴性(0～3 mmol/L);在濃度為5 mmol/L時，Sr對Gli1表達的促進作用有所下降，但與對照組比較，仍有統計學意義(P＜0.01);而在10 mmol/L Sr濃度組，細胞內Gli1表達水平與對照組差別無統計學意義(P＞0.05)。圖1B顯示，應用3 mmol/L Sr作用BMSCs 3 d時，細胞內Gli1表達水平與對照組差別無統計學意義(P＞0.05)，而作用5 d、7 d和14 d后，Gli1表達均顯著高于對照組(P＜0.05)，且在7 d時Gli1表達水平達最高值。

Figure 1.The effects of Sr on the expression of Gli1 in rat BMSCs.A:the cells were treated with the indicated concentrations of Sr for 7 d;B:the cells were treated with 3 mmol/L Sr for different time.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 Sr對BMSCs Gli1表達的影響

2 Hedgehog受體拮抗劑Cy抑制Sr對BMSCs Gli1的上調作用

圖2顯示，3 mmol/L Sr作用于BMSCs 7 d，可明顯地增加Gli1的表達水平，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。當同時應用10 μmol/L Cy與3 mmol/L Sr作用BMSCs 7 d時，可使Gli1表達明顯減少，與Sr組相比，差異有統計學意義(P＜0.05);單獨10 μmol/L Cy對Gli1的基礎表達無明顯影響。

Figure 2.Cyclopamine(Cy，10 μmol/L)inhibited Sr－induced over－expression of Gli1 in rat BMSCs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs Sr.圖2 Cy抑制Sr對BMSCs Gli1表達的上調作用

3 Gli1-siRNA有效鏈的篩選

圖3顯示，與non－target siRNA組相比較，Gli1－siRNA001未能降低Gli1表達，差別無統計學意義，而Gli1－siRNA002及Gli1－siRNA003均能降低Gli1蛋白的表達(P＜0.05)，其中Gli1－siRNA002的作用最為明顯(P＜0.01)。

Figure 3.Screening of the effective Gli1－siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs non－target siRNA.圖3 Gli1-siRNA有效鏈的篩選

4 Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Gli1表達的上調作用

圖4顯示，3 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d，Gli1表達較對照組明顯增加(P＜0.01);Gli1－siRNA及non－target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3 mmol/L Sr處理細胞7 d，Gli1－siRNA可使Sr對Gli1表達的上調作用受到明顯抑制，與Sr組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，而non－target siRNA組對Sr上調Gli1表達的作用無明顯影響。

Figure 4.Gli1－siRNA inhibited over－expression of Gli1 induced by Sr in rat BMSCs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Sr.圖4 Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Gli1表達的上調作用

5 Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Runx2表達的上調作用

圖5顯示，3 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d，Runx2表達較對照組明顯增加(P＜0.01);Gli1－siRNA及non－target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3 mmol/L Sr處理細胞7 d，Gli1－siRNA可使Sr對Runx2表達的上調作用受到明顯抑制，與Sr組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，而non－target siRNA組對Sr上調Runx2表達的作用無明顯影響。

Figure 5.Gli1－siRNA inhibited over－expression of Runx2 induced by Sr in rat BMSCs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Sr.圖5 Gli1-siRNA抑制Sr對BMSCs Runx2表達的上調作用

6 Gli1-siRNA拮抗Sr對ALP活性的促進作用

圖6顯示，與對照組相比，3 mmol/L Sr處理BMSCs 7 d明顯增加ALP活性(P＜0.01);Gli1－siRNA及non－target siRNA分別轉染BMSCs后，再予3 mmol/L Sr處理細胞7 d，Gli1－siRNA可使Sr對ALP活性的促進作用受到明顯抑制，與Sr組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，而non－target siRNA組對Sr促進ALP活性的作用無明顯影響。

Figure 6.Transfection with Gli1－siRNA inhibited Sr－induced enhancement of ALP activity in rat BMSCs.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs Sr.圖6 Gli1-siRNA拮抗Sr對BMSCs ALP活性的促進作用

7 Gli1-siRNA拮抗Sr對鈣結節形成的促進作用

圖7顯示，與對照組相比，3 mmol/L Sr處理BMSCs 21 d明顯增加鈣結節的數量;Gli1－siRNA轉染BMSCs后，使Sr對鈣結節形成的促進作用受到明顯抑制，而non－target siRNA轉染后，對Sr促進鈣結節形成的作用無影響。

Figure 7.Transfection with Gli1－siRNA inhibited Sr－induced mineralization in rat BMSCs(alizarin red staining，×100).A:control group;B:Sr group;C:Sr+ Gli1－siRNA group;D:Sr+non－target siRNA group.圖7 Gli1-siRNA拮抗Sr對BMSCs鈣結節生成的促進作用

討論

Hedgehog信號轉導通路由Hh配體、膜蛋白受體復合物(Ptch和Smo)、核轉錄因子Gli和下游靶基因4部分組成。在脊椎動物中，Hh配體包含3個家族成員:Shh、Desert Hedgehog(Dhh)和Indian Hedgehog(Ihh)，其中Shh表達最為廣泛。下游轉錄因子Gli型鋅指蛋白家族有3個成員，即Gli1、Gli2和Gli3，其中，起主要激活信號傳遞的是Gli1、Gli2、Gli3既可表現為激活又可表現為抑制作用。在Hh信號轉導過程中，Hh、Smo、Gli作為激動因子發揮正調節作用，而Ptch作為抑制因子發揮負調節作用［8］。在誘導MSCs成骨分化方面，Hedgehog是否通過其下游轉錄因子Gli1產生作用仍然有爭論，Ma等［9］發現地塞米松可通過增加Shh表達誘導BMSCs成骨分化，但此過程不依賴于Gli1的表達;而van等［10］研究表明外源性Shh可增加Gli1表達，刺激未分化KS483細胞向成骨分化，而與Gli2和Gli3無明顯相關;Oliveira等［11］在研究中采用hMSCs，在無成骨誘導培養液中培養，添加Hedgehog受體激動劑Purmorphamine可增加Gli1、Gli2及成骨分化重要轉錄因子Runx2的表達。Runx2在成骨分化和骨形成方面起重要作用，是啟動成骨作用的一個關鍵轉錄因子［12］，然而Gli1對于Runx2表達的影響尚無明確定論，Zunich等［13］、Hojo等［14］表明Gli1在一定程度上不依賴與Runx2參與成骨分化作用，Kim等［15］則發現Gli1可增加Runx2的活性以及轉錄從而促進軟骨鈣化。

我們的前期研究表明，Sr可通過上調Shh表達促進大鼠骨髓間充質干細胞向成骨分化［7］。本研究在原有的基礎上進一步證實，Sr在促進BMSCs向成骨細胞分化的過程中，明顯促進了Gli1的表達。為進一步明確Hedgehog受體在此調控中的影響，本研究在應用Sr前，加入Hedgehog受體的抑制劑Cy。結果表明，Cy可以明顯抑制Sr對Gli1的上調作用，提示Hedgehog受體介導Sr對Gli1的上調作用，Oliveira等［11］指出，Hedgehog受體激動劑可增加Gli1的表達，支持本文的結果。另一方面，為了證實Gli1在Sr促進BMSCs向成骨分化中的作用，本研究使用Gli1－siRNA下調Gli1的表達后，發現Sr對Runx2的上調作用明顯減弱，并且拮抗了Sr對成骨早期指標ALP的活性及晚期指標鈣結節形成的促進作用，提示Gli1分子在Sr促進BMSCs向成骨分化中起著重要作用。

綜上所述，本文進一步證實了Sr可通過激活Hedgehog受體調節Gli1表達，而Gli1分子在Sr促進BMSCs向成骨分化中起著重要作用，包括促進Runx2表達、增加ALP活性及鈣結節形成。由此可見，激活Hedgehog/Gli1通路可能是Sr促進BMSCs向成骨分化的重要機制之一。這些結果為臨床上應用于Sr防治骨質疏松等疾病提供了新穎的實驗依據。

［1］Kanis JA，Johansson H，Oden A，et al.A meta－analysis of the effect of strontium ranelate on the risk of vertebral and non－vertebral fracture in postmenopausal osteoporosis and the interaction with FRAX?［J］.Osteoporos Int，2011，22(8):2347－2355.

［2］Choudhary S，Halbout P，Alander C，et al.Strontium ranelate promotes osteoblastic differentiation and mineralization of murine bone marrow stromal cells:involvement of prostaglandins［J］.J Bone Miner Res，2007，22(7): 1002－1010.

［3］Peng S，Zhou G，Luk KD，et al.Strontium promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through the Ras/MAPK signaling pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2009，23(1－3):165－174.

［4］Fromigue O，Hay E，Barbara A，et al.Essential role of nuclear factor of activated T cells(NFAT)－mediated Wnt signaling in osteoblast differentiation induced by strontium ranelate［J］.J Biol Chem，2010，285(33):25251－25258.

［5］黃曉丹，呂輝珍，靳思思，等.雷奈酸鍶通過TGF－β1/ Smad通路促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化［J］.中國病理生理雜志，2013，29(2):302－307.

［6］呂輝珍，黃曉丹，靳思思，等.雷奈酸鍶通過骨形態發生蛋白－2/Smad通路促進骨髓間充質干細胞成骨分化［J］.南方醫科大學學報，2013，33(3):376－381.

［7］靳思思，胡潔芬，吳文.Shh在雷奈酸鍶促進骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用［J］.中國病理生理雜志，2014，30(1):159－164.

［8］Pan A，Chang L，Nguyen A，et al.A review of hedgehog signaling in cranial bone development［J］.Front Physiol，2013，4:61.

［9］Ma X，Zhang X，Jia Y，et al.Dexamethasone induces osteogenesis via regulation of hedgehog signalling molecules in rat mesenchymal stem cells［J］.Int Orthop，2013，37 (7):1399－1404.

［10］van der Horst G，Farih－Sips H，Lowik CW，et al.Hedgehog stimulates only osteoblastic differentiation of undifferentiated KS483 cells［J］.Bone，2003，33(6):899－910.

［11］Oliveira FS，Bellesini LS，Defino HL，et al.Hedgehog signaling and osteoblast gene expression are regulated by purmorphamine in human mesenchymal stem cells［J］.J Cell Biochem，2012，113(1):204－208.

［12］Gersbach CA，Byers BA，Pavlath GK，et al.Runx2/ Cbfa1 stimulates transdifferentiation of primary skeletal myoblasts into a mineralizing osteoblastic phenotype［J］.Exp Cell Res，2004，300(2):406－417.

［13］Zunich SM，Douglas T，Valdovinos M，et al.Paracrine sonic hedgehog signalling by prostate cancer cells induces osteoblast differentiation［J］.Mol Cancer，2009，8:12.

［14］Hojo H，Ohba S，Yano F，et al.Gli1 protein participates in Hedgehog－mediated specification of osteoblast lineage during endochondral ossification［J］.J Biol Chem，2012，287(21):17860－17869.

［15］Kim EJ，Cho SW，Shin JO，et al.Ihh and Runx2/Runx3 signaling interact to coordinate early chondrogenesis:a mouse model［J］.PLoS One，2013，8(2):e55296.

Strontium ranelate promotes osteogenic differentiation of rat bone mesenchymal stem cells through Hedgehog/Gli1 signaling pathway

HU Jie－fen1，2，LIAO Jing－qiu1，2，ZHANG Wei－jie2，XU Ling2，ZHI Xi－mei2，LIN Kai2，WU Wen2

(1Southern Medical University，Guangzhou 510515，China;2Department of Endocrinology，East Ward，Guangdong Geriatric Institute，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China.E-mail: wuwen1964@163.com)

AIM:To explore whether strontium ranelate(Sr)promotes osteogenic differentiation of rat bone mesenchymal stem cells(BMSCs)through the Hedgehog/Gli1 signaling pathway.METHODS:BMSCs were isolated from 4－week－old rats by adherent culture and induced to differentiate into osteoblasts.According to the experimental purposes，the cells were exposed to different concentrations of Sr，cyclopamine(Cy，an inhibitor of Hedgehog receptor)or Gli1－siRNA.The expression of Gli1 and Runx2 in the cells was detected by Western blotting.The activity of alkaline phosphatase (ALP)was measured by the method of colorimetry，and the mineralized nodules were observed under microscope with alizarin red staining.RESULTS:Exposure to Sr at concentrations of 0.1 to 5 mmol/L for 7 d markedly increased the expression of Gli1 in the BMSCs，and the increase in Gli1 expression was the most obvious following Sr exposure at concentration of 3 mmol/L.Cy at concentration of 10 μmol/L inhibited Sr－induced up－regulation of Gli1 expression.Transfection of the BMSCs with Gli1－siRNA not only obviously inhibited Sr－induced up－regulation of Gli1 and Runx2(a downstream protein of Gli1)expression，but also antagonized Sr－induced enhancement of ALP activity and the formation of mineralized nodules.CONCLUSION:The Hedgehog/Gli1 pathway is involved in Sr－induced osteogenic differentiation of rat BMSCs.

Strontium ranelate;Bone mesenchymal stem cells;Hedgehog protein;Gli1 protein;Runx2 protein

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.008

1000－4718(2015)02－234－05

2014－11－11

2015－01－07

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2012010009403);廣東省科技計劃(No.2011B031800002);廣州市科技計劃(No.2012J4300082)

△通訊作者Tel:020－83827812;E－mail:wuwen1964@163.com