通心絡對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43重構及室性心律失常的影響*

李華波，陳世健，胡建華，汪蓮開

(湖北民族學院附屬民大醫院心內科，湖北 恩施 445000)

通心絡對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43重構及室性心律失常的影響*

李華波，陳世健，胡建華，汪蓮開△

(湖北民族學院附屬民大醫院心內科，湖北 恩施 445000)

目的:探討通心絡(TXL)對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43(Cx43)重構及室性心律失常(VA)的影響。方法:雄性SD大鼠100只，隨機分為假手術(sham)組(n=25)和手術組(n=75)。手術組動物結扎冠狀動脈左前降支制備心肌梗死模型，假手術組只開胸不結扎。將手術后存活3 d的大鼠隨機分為TXL治療組(TXL組)和心肌梗死組(MI組)。TXL組給予TXL(2 g·kg－1·d－1)連續4周灌胃治療，MI組和sham組則給予等體積生理鹽水灌胃。藥物干預結束后，采用酶聯免疫吸附法檢測梗死周邊區心肌組織白細胞介素－1β(IL－1β)及內皮素－1 (ET－1)的水平;免疫組化法檢測Cx43的分布;Western blotting法檢測Cx43表達;RT－PCR法檢測Cx43 mRNA的表達;采用Burst刺激誘發VA。結果:與sham組相比，MI組梗死周邊心肌的IL－1β和ET－1水平均顯著升高，而Cx43的mRNA及蛋白表達均顯著降低，Cx43分布無規律性且側面化分布增多，VA誘發率也明顯升高(P＜0.05);與MI組相比，TXL組梗死周邊心肌IL－1β和ET－1水平明顯降低，Cx43的mRNA及蛋白表達均顯著增加，Cx43部分呈線性分布于心肌細胞閏盤處，VA誘發率也明顯降低(P＜0.05)。結論:TXL可降低心肌梗死大鼠VA的發生率，其機制可能與TXL抑制心肌梗死后Cx43重構有關。

心肌梗死;通心絡;縫隙連接蛋白43;室性心律失常

縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是一種溝通相鄰細胞胞質的連接通道，它廣泛分布于心肌組織，為心肌細胞間提供了低電阻的信號傳導途徑。一些研究結果顯示心肌梗死(myocardial infarction，MI)后存在Cx43重構的現象，具體表現為梗死心肌Cx43表達下降及側面化分布增多［1－2］。這些研究還表明Cx43的這種重構可能與心肌梗死后室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)及猝死的發生有關。通心絡(tongxinluo，TXL)是祖國醫學中依據絡病學理論研制而成的一種復方制劑，既往細胞水平研究發現TXL可抑制異丙腎上腺素引起的心肌細胞Cx43 mRNA表達下調［3］，由此提示我們，TXL可能具有改善心肌梗死后Cx43重構的作用，從而降低心肌梗死后VA的發生率。本研究通過給予心肌梗死大鼠TXL干預，探討用TXL治療對大鼠心肌梗死后Cx43重構及VA誘發率的影響。

材料和方法

1 動物分組、模型制備及藥物干預

實驗用雄性SD大鼠100只，體重200～250 g，由武漢大學醫學部實驗動物中心提供。隨機將動物分為假手術(sham)組(n=25)和手術組(n=75)。手術組動物給予3%苯巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，10 min后自左側3～4肋間開胸，暴露心臟，采用冠狀動脈左前降支結扎的方法制備心肌梗死模型。術中心電監護，以心電圖II導聯ST段抬高和缺血區域心肌顏色改變作為造模成功的標志。心肌梗死造模后存活3 d大鼠共64只，隨后被隨機分成TXL治療組(TXL組，n=32)和心肌梗死組(MI組，n =32)。假手術組動物采用相同的開胸方法，但是只剪開心包腔，不結扎冠狀動脈。于造模后第4天，TXL組參照文獻［4］給予TXL(2 g·kg－1·d－1)灌胃治療連續4周，而MI組和sham組則給予等體積生理鹽水連續灌胃4周。

2 實驗方法

2.1 心肌組織白細胞介素－1β(interleukin－1β，IL－1β)及內皮素－1(endothelin－1，ET－1)水平的檢測

每組各選4只動物給予戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后處死，迅速取出心臟，取梗死周邊區左室心肌組織100 mg，加入0.6 mL生理鹽水，用組織勻漿機按10 000～15 000r/min上下研磨制成組織勻漿(勻漿時間10秒/次，間隙30 s，連續3～5次，在冰水中進行)，迅速勻漿后，以14 000 r/min在4℃下離心10 min，取上清存放于－80℃冰箱待用。測定前用生理鹽水將上清液體積調為1 mL。采用酶聯免疫吸附試驗試劑盒測定心肌組織中的IL－1β及ET－1水平，ELISA試劑盒購自RD，操作過程嚴格按照試劑盒說明書完成。

2.2 RT－PCR檢測Cx43 mRNA的表達量每組各選4只動物安樂死后迅速取出心臟，剪下梗死周邊區左心室組織100 mg，加入1 mL預冷的Trizol在冰上充分研磨提取總RNA。根據Fermentas反轉錄試劑盒說明，將提取的總RNA反轉錄為cDNA，并置于－20oC冰箱保存備用。使用Primer 5.0設計引物并由Invitrogen公司合成。上游引物序列為5’－TGAAAGAGAGGTGCCCAGA－3’，下游引物序列為5’－CGTGAGAGATGGGGAAGGACT－3’。

2.3 Western blotting檢測Cx43及磷酸化Cx43(p－Cx43)蛋白表達量每組各選4只動物安樂死后迅速取出心臟，剪下梗死邊緣區左心室組織100 mg，將組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃12 000×g離心15 min，取上清，進行蛋白質定量后貯存于－80℃冰箱。利用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，置于5%脫脂奶粉中4℃過夜，分別加入1∶1 000稀釋的I抗(Cx43多克隆抗體和p－Cx43多克隆抗體)和1∶1500的β－actin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入1∶1 500稀釋的HRP標記的羊抗兔II抗(IgG)中室溫下孵育1 h，然后TBST洗膜3次。將膜與ECL反應1～5 min后，曝光于感光膠片上，顯影、定影。

2.4 在體VA的誘發將各組剩下的動物行在體電生理研究。以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg，Sigma)行腹腔注射麻醉，多導電生理記錄儀記錄大鼠的體表II導聯心電圖。將1對鉑金刺激電極(兩電極間距為1 mm)連接于LEAD2000B多道電生理儀(四川錦江通用實業有限公司)，動物開胸后，將刺激電極置于右室流出道行Burst刺激(給予50 Hz持續時間2 s的Train刺激，總刺激時間小于2 min)誘發VA。VA持續時間超過2 s即記為VA可誘發，超過30 s即記為持續性室性心律失常(SVA)［5］。

2.5 免疫組化分析Cx43的分布在體電生理研究結束后，每組各選5個心臟行免疫組化分析Cx43的分布情況。取梗死周邊區心肌組織標本，常規石蠟包埋切片，片厚4～5 μm，每個心臟做3張切片。組織切片加入I抗Cx43單克隆抗體(1∶200，Chemicon)后置于4°C濕盒中孵育過夜;第2天用PBS沖洗切片3次，每次2 min，吸水紙擦干切片后滴加熒光素標記的羊抗鼠多克隆IgG(1∶100，Zymed)，37℃孵育20～30 min。Cx43陽性的表達區域由Image－Pro Plus 4.0軟件及專用顯微鏡組成的計算機圖像處理系統進行定量測定，其結果通過Cx43陽性表達區域在總面積中所占的比例表示。

3 統計學處理

使用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，正態分布計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析;計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 動物的存活情況

Sham組25只大鼠，其中1只在飼養過程中死亡，存活率為96.00%(24/25)。75只造模大鼠11只在手術后3 d內死亡，剩下64只隨機分為TXL組和MI組，每組32只。到藥物灌胃治療結束時，TXL組有3只大鼠死亡，存活率為90.62%，MI組有10只死亡，存活率為68.75%。TXL組的大鼠存活率高于MI組(P＜0.05)。

2 心肌IL-1β及ET-1水平的測定結果

Sham組心肌組織未能檢測出IL－1β，而TXL組梗死周邊區IL－1β水平顯著低于MI組(P＜0.01)。與sham組相比，MI組梗死周邊區的ET－1水平顯著升高(P＜0.01)。經TXL治療后，TXL組心梗周邊區的ET－1水平較MI組下降(P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The levels of IL－1β and ET－1 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖1 3組動物心肌IL-1β及ET-1水平的比較

3 Cx43 mRNA的表達結果

RT－PCR結果顯示，MI組梗死周邊區Cx43的mRNA水平較sham組顯著下降，而給予TXL治療后，TXL組梗死周邊區Cx43的mRNA水平較MI組升高(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05 vs MI group.圖2 3組動物心肌梗死周邊區Cx43 mRNA表達的比較

4 Cx43的蛋白表達結果

Western blotting實驗檢測了Cx43及p－Cx43蛋白在3組動物間的表達，結果顯示，與sham組相比，MI組梗死周邊區心肌Cx43蛋白總表達量及磷酸化水平均顯著下降(P＜0.01)。給予TXL治療后，梗死周邊區的Cx43蛋白總表達量及磷酸化水平均較MI組明顯升高(P＜0.01)。此外，雖然TXL組梗死周邊區的Cx43蛋白總表達量較sham組下降(P＜0.05)，但磷酸化的Cx43蛋白水平在2組間卻無明顯差異(P＞0.05)，見圖3。

5 在體VA誘發的結果

Sham組只有1只動物誘發出了非持續性VA，VA誘發率為8.33%。MI組的VA誘發率為90.00%，且66.70%為持續性VA，與sham組比較，差異顯著(P＜0.01)。經TXL治療4周后，VA的誘發率為52.94%，持續性VA的誘發率為17.64%，均較MI組明顯減低(P＜0.05)，見圖4。

6 Cx43的含量及分布結果

Sham組的Cx43多分布在心肌閏盤處，與心肌纖維走行垂直;MI組的Cx43表達較sham組明顯減少(P＜0.01)，且幾乎均分布于心肌側面，與心肌纖維走行平行;TXL組的Cx43表達較MI組增加(P＜0.01)，且可見部分Cx43分布于閏盤處，見圖5。

Figure 3.The protein level of Cx43 in the cardiac tissues of the rats with different treatments.Mean±SD.n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖3 3組動物心肌Cx43蛋白表達的比較

Figure 4.The typical ECG images of VA and the incidence of VA in the rats with different treatments.圖4 3組動物典型的室性心律失常誘發結果圖

Figure 5.The immunofluorescent staining for Cx43 expression(arrows)from the border zone of the cardiac tissues in the rats with different treatments(×400).Cx43 signals were mainly located at end－to end apposition among the neighboring cells in the sham group.In contrast，infarction markedly decreased Cx43 expression.After administration of TXL，Cx43 signals were increased.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs MI group.圖5 3組心肌梗死周邊區Cx43的表達及分布情況

討論

心肌梗死后常易并發各種心律失常，其中VA尤為多見，是心肌梗死患者發生心源性猝死的主要原因［2，6］。TXL是一種臨床上廣泛應用的中成藥，由人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、赤芍、土鱉蟲等12種中藥成分組成，具有益氣通絡、化瘀通絡、流氣通絡等作用。既往研究證實，TXL可通過改善心肌梗死后交感神經重構及電重構(包括縮短心肌動作電位時程、延長有效不應期及減小心室跨壁離散度等)進而抑制心肌梗死后VA的發生［4，7］。近些年的一些研究顯示心肌梗死后Cx43的重構也參與了心肌梗死后VA的發生［1－2］。然而，TXL對心肌梗死后Cx43重構的影響及其與梗死后VA的關系既往并無相關研究。本研究首次對這一問題進行了初步探討，以期為TXL治療心肌梗死后VA提供一定的理論依據。

哺乳動物心肌細胞間廣泛存在縫隙連接蛋白，心室組織中以Cx43為主，它與心臟維持正常的電傳導密切相關。在一些病理條件下，為適應心功能的變化，縫隙連接蛋白可在短時間內發生重構。這種重構容易誘發各種心功能紊亂，其中惡性心律失常的發生尤為多見［8］。心肌梗死后心肌細胞Cx43的重構，主要涉及Cx43表達量顯著減少、側面化分布增加及磷酸化水平降低3個方面。其中，Cx43表達量顯著減少可引起心肌細胞電傳導速度減慢［9］。而Cx43的側面化分布一方面使心肌細胞電信號由各向異性傳導的形式轉變為繞彎式傳導，為折返的發生提供基礎［10］;另一方面這些側面化分布的Cx43可以以半通道的形式開放釋放ATP，同時促進Na+通過Cx43半通道內流誘發延遲后除極，進而誘發心律失常［11－12］。此外，有研究證實Cx43的磷酸化水平與Cx43的分布特點有明顯的相關性，具體表現為磷酸化Cx43水平增加則Cx43多分布于心肌閏盤處，而非磷酸化Cx43水平增加則Cx43多分布于心肌側面［13］，即心肌梗死后Cx43磷酸化水平的降低可促進Cx43的側面化分布，進而為心律失常的發生提供條件?？傊珻x43這3個方面的重塑在一定程度上發揮協同作用，最終導致VA的發生。本研究發現，心肌梗死大鼠經TXL治療后可以上調梗死周邊區Cx43的表達量、促進Cx43的正常分布及增加Cx43磷酸化水平，這可能是TXL可以減少心肌梗死后VA發生的重要原因。

此外，既往研究顯示心肌組織中的IL－1β及ET－1水平與心肌Cx43蛋白表達量有關［14－15］，其中IL－1β可通過核因子κB途徑抑制Cx43合成，而ET－1則通過PLC/DAG/PKC途徑使Cx43過度磷酸化而誘導Cx43的降解。在本研究中，TXL減少了心肌梗死大鼠梗死周邊區IL－1β及ET－1水平，我們推測這可能與TXL上調梗死周邊區Cx43的表達量有關。

總之，TXL可降低心肌梗死大鼠的VA發生率，其機制可能與TXL抑制心肌梗死后Cx43重構有關。

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Effects of Tongxinluo on connexin 43 remodeling and ventricular arrhythmia after myocardial infarction in rats

LI Hua－bo，CHEN Shi－jian，HU Jian－hua，WANG Lian－kai

(Department of Cardiovascular Diseases，The Min Da Hospital Affiliated to Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China.E-mail:1249245691@qq.com)

AIM:To determine the effects of Tongxinluo(TXL)on connexin 43(Cx43)remodeling and ventricular arrhythmia(VA)after myocardial infarction(MI)in rats.METHODS:Male SD rats were randomly divided into sham－operated(sham)group(n=25)and operation group(n=75).The left anterior descending(LAD)was ligated in operated group，while the rats in sham group only underwent pericardiotomy.The rats in operation group which survived for 3 d after operation were randomly assigned to TXL group and MI group.The rats in TXL group was administrated with TXL (2 g·kg－1·d－1，intragastric administration)for 4 weeks，while normal saline was applied to the rats in sham group and MI group.The levels of interleukin－1β(IL－1β)and endothelin－1(ET－1)in the tissue from the border zone were measured by ELISA after treatment.The distribution and the mRNA and protein expression of Cx43 were detected by immunohistochemical staining，RT－PCR and Western blotting，respectively.The burst pacing was used to induce ventricular arrhythmia (VA).RESULTS:Compared with sham group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly increased，while the mRNA and protein expression of Cx43 was markedly reduced with irregular distribution in MI group (P＜0.05).Compared with MI group，the levels of IL－1β and ET－1 and the incidence of VA were significantly reduced，while the expression of Cx43 at mRNA and protein levels was markedly increased with augmented linear distribution in the myocardial cell intercalated disc in TXL group(P＜0.05).CONCLUSION:TXL reduces the incidence of VA after MI via inhibiting the Cx43 remodeling.

Myocardial infarction;Tongxinluo;Connexin 43;Ventricular arrhythmia

R542.2+2;R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.015

1000－4718(2015)02－274－05

2014－09－03

2015－01－04

恩施州2013年農社領域技術研發項目

△通訊作者Tel:0718－8301036;E－mail:1249245691@qq.com