子癇前期患者胎盤組織中visfatin蛋白與mRNA表達及意義*

王江玲，陳思思，唐杰，王思璐，萬麗，黃引平△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1產科，2外科實驗室，3病理科，浙江 溫州 325000)

子癇前期患者胎盤組織中visfatin蛋白與mRNA表達及意義*

王江玲1，陳思思1，唐杰1，王思璐2，萬麗3，黃引平1△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1產科，2外科實驗室，3病理科，浙江 溫州 325000)

目的:探討內脂素(visfatin，VF)在子癇前期(PE)患者胎盤組織中的表達及意義。方法:選擇2011年8月至2013年12月在溫州醫科大學附屬第一醫院住院分娩的孕婦共計100例，根據病情輕重分為重度PE組、輕度PE組和正常妊娠組。采用蘇木素－伊紅染色法觀察3組胎盤組織病理變化;免疫組化法及real－time PCR技術分別檢測3組胎盤VF蛋白及mRNA的表達并分析其與子癇前期發病的關系。結果:PE的病理改變主要表現為細胞滋養細胞及合體滋養細胞結構紊亂且形態不完整;細胞滋養細胞增生，合體滋養細胞結節增多;絨毛毛細血管減少、淤血。免疫組化及real－time PCR結果顯示胎盤組織中內脂素定位于合體及細胞滋養層細胞的胞漿，隨著病情的加重，VF蛋白及mRNA表達量逐漸升高，重度PE組明顯高于正常妊娠組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論:PE患者存在絨毛血管內皮細胞損傷和功能紊亂。胎盤VF蛋白及mRNA在PE孕婦中高表達，表明VF與PE的發生具有一定關系。

子癇前期;胎盤;內脂素;血管內皮損傷

子癇前期(preeclampsia，PE)是妊娠中晚期特有的并發癥，臨床上以高血壓、蛋白尿為主要特征，是造成孕產婦、圍生兒死亡的主要原因之一［1］。子癇前期的病因及發病機制尚未明確，目前研究認為代謝綜合征、低齡、初產婦、多胎妊娠、易栓癥等是子癇前期的重要危險因素;同時，胎盤絨毛淺著床、血管內皮損傷、氧化應激、免疫學因素、遺傳因素等在子癇前期發生發展中起著重要作用［2］。內脂素(visfatin，VF)是新近發現的一種脂肪細胞因子，具有增加胰島素敏感性、參與炎癥反應及促進血管生成等作用［3］，因此我們推測內脂素可能與子癇前期發生存在一定的關聯。本研究旨在通過檢測子癇前期患者胎盤VF蛋白與mRNA的表達來探討內脂素與子癇前期的發病關系。

資料和方法

1 資料

1.1 子癇前期診斷標準參照樂杰［1］主編的第7版《婦產科學》的定義，輕度子癇前期為妊娠20周以后出現BP≥140/90 mmHg，尿蛋白≥0.3 g/24 h或隨機尿蛋白(+);重度子癇前期為妊娠20周以后出現BP≥160/110 mmHg;尿蛋白≥2.0 g/24 h或隨機尿蛋白≥(++)。所有孕婦排除慢性高血壓病、妊娠期糖尿病、慢性腎炎、腫瘤等疾病。

1.2 研究對象及分組選擇2011年8月至2013年12月在我院定期產檢和住院分娩的孕婦共計100例，根據病情輕重分為:輕度子癇前期孕婦30例(均為足月妊娠，其中初產婦16例、經產婦14例);重度子癇前期孕婦30例(其中足月妊娠8例——重度子癇前期足月組、未足月妊娠22例——重度子癇前期未足月組;初產婦19例、經產婦11例)，另選取同期正常妊娠孕婦40例(均為足月妊娠，其中初產婦22例、經產婦18例)。

該實驗獲得溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準及研究對象的知情同意。

2 實驗方法

2.1 主要試劑及設備兔抗人內脂素單克隆抗體(上海微蒙生物科技有限公司);免疫組化試劑盒(上海博谷生物科技有限公司);Trizol總RNA提取試劑盒(Life Technologies);反轉錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司);real－time PCR相關試劑盒(TaKaRa); Leica顯微鏡DM4000B(Leica);梯度PCR儀，定量PCR儀7500(Life Technologies);引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of primers for real－time PCR

2.2 標本采集及處理所有孕婦胎盤娩出后5 min內于臍帶周圍母體面縱向切取胎盤2塊(約1.0 cm ×1.0 cm×1.0 cm，避開明顯纖維化、鈣化區)，無菌生理鹽水反復沖洗，濾紙吸干。1塊放入10%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、連續切片，厚度4 μm;另1塊胎盤放入無菌去酶凍存管中，放置于液氮中速凍24 h，取出并放于－80℃低溫冰箱中保存備用。

2.3 蘇木素－伊紅(HE)染色法觀察胎盤病理變化

嚴格按照步驟做常規HE染色，高倍鏡下(×100)下觀察胎盤絨毛結構及絨毛間毛細血管形態。

2.4 免疫組織化學染色法檢測胎盤內脂素蛋白表達采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶(SP)法，嚴格按說明書操作。胎盤絨毛合體或細胞滋養細胞的胞漿出現棕黃色顆粒判定為陽性細胞。每例隨機選用1張切片，高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，Image－Pro Plus 6.0(IPP 6.0)專業圖像分析軟件測定每張圖片積分吸光度值(integral absorbance，IA)并取其平均值作為該標本內脂素蛋白相對表達量。用磷酸鹽緩沖液代替兔抗人內脂素單克隆抗體作為陰性對照，以小鼠內臟脂肪切片代替胎盤組織切片作為陽性對照。

2.5 實時熒光定量PCR技術檢測胎盤內脂素mRNA表達嚴格按說明書用Trizol總RNA提取試劑盒提取胎盤RNA，加入30 mL DEPC水溶解，RNA放置于－80℃冰箱儲存。測定260、280 nm處的吸光度，取A260/A280比值在1.8～2.2之間的RNA進行逆轉錄。按下法反轉錄cDNA:RNA 1.0 μL，65℃變性5 min后迅速放于冰上降溫，加入5×RT buffer 2.0μL，Enzyme Mix 0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，Nucleasefree水6.0 μL混勻，42℃20 min，98℃5 min逆轉錄成cDNA，加DEPC水稀釋3倍。熒光定量PCR:每孔加入SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)5.0 μL，PCR Forward Primer(1 μmol/L)0.5 μL，PCR Reverse Primer(1 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，Nuclease－free水2.0 μL混勻，放置于定量PCR儀7500中。反應條件為:95℃3 min;95℃15 s，62℃1 min，72℃30 s，40個循環;72℃5 min。用2－ΔΔCt計算內脂素mRNA的相對表達量。

3 統計學處理

數據采用SPSS 13.0統計分析軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，比較前先進行正態性檢驗及方差齊性檢驗。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間均數兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 3組臨床資料的比較

3組孕婦的孕次、產次、年齡和孕早期體重指數無明顯差異，重度PE組收縮壓和舒張壓高于其它2組(P＜0.05)，分娩孕周和新生兒體重低于其它2組(P＜0.05);輕度PE組收縮壓高于正常組(P＜0.05)，舒張壓、分娩孕周和新生兒體重與正常組無明顯差異，見表2。

表2 3組臨床資料比較Table 2.The comparison of the clinical data(Mean±SD)

2 產婦胎盤HE染色病理學的改變

正常妊娠組胎盤絨毛中滋養層細胞以合體滋養層細胞為主，細胞滋養細胞及合體滋養細胞結構清晰且形態完整。重度子癇前期組胎盤絨毛大部分不成熟、絨毛間質損傷，細胞滋養細胞及合體滋養細胞結構紊亂且形態不完整，細胞滋養層細胞增生明顯，合體滋養層細胞結節增多，絨毛毛細血管減少、淤血。輕度子癇前期組細胞滋養細胞及合體滋養細胞結構欠清晰，形態欠完整，少數絨毛存在毛細血管減少及淤血，見圖1。

Figure 1.The HE staining of placenta tissues in each group under light microscope(×100).A:severe PE group，intense capillary vascular gore(arrow head);B:mild PE group，weak villous capillary gore(arrow head);C:normal pregnancy group，no villous capillary gore.圖1 3組胎盤組織HE染色

3 VF蛋白免疫組織化學的結果分析

3組胎盤組織絨毛合體及細胞滋養層細胞胞質內均可見內脂素蛋白的陽性表達，陰性對照未見內脂素蛋白的陽性表達，陽性對照大鼠內臟脂肪細胞胞質內可見內脂素蛋白的陽性表達，見圖2。隨著子癇前期程度的加重，VF蛋白相對表達量也隨之升高，正常妊娠組的IA為76 921±48 538，輕度PE組IA為99 342±30 335，重度PE組IA為140 641±69 365，單因素方差分析示尚不能認為3組胎盤內脂素蛋白含量有統計學差異(P＞0.05)。兩兩比較顯示重度PE組胎盤的VF蛋白表達量明顯高于正常組，差異有統計學意義(P＜0.05);輕度PE組胎盤的VF蛋白表達量與正常組無明顯差異;重度PE組胎盤的VF蛋白表達量與輕度PE組無明顯差異，見圖3。在重度PE組中，足月患者的IA為155 570±79 063，未足月患者的IA為135 212±50 174，二者比較無明顯差異。

Figure 2.The immunohistochemical staining of visfatin in placenta(×400).A:severe PE group，showed intense visfatin immunostaining in cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells(arrow head);B:mild PE group，showed moderate visfatin immunostaining in cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells(arrow head);C:normal pregnancy group，showed weak visfatin immunostaining in cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells(arrow head);D:negative control，no primary antibody，showed no visfatin immunostaining;E:positive control，showed intense visfatin immunostaining in visceral adipose cells (arrow head).圖2 胎盤內脂素蛋白表達

Figure 3.The protein expression of visfatin in the placenta of patients with preeclampsia determined by immunohistochemistry.The data were expressed as IA(integral absorbance).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normal pregnancy group.圖3 3組內脂素蛋白的相對表達量

4 3組產婦胎盤VF mRNA表達水平的比較

3組孕婦胎盤均表達內脂素mRNA。經2－ΔΔCt法計算得，正常妊娠組mRNA相對表達量為1.06± 0.37，輕度PE組為1.70±0.91，重度PE組為2.53 ±1.21，單因素方差分析提示尚不能認為3組內脂素mRNA表達量存在統計學差異(P＞0.05)。兩兩比較顯示重度PE組內脂素的mRNA表達水平明顯高于正常妊娠組(P＜0.05);輕度PE組內脂素的mRNA表達水平與正常妊娠組無明顯差異;重度PE組與輕度PE組內脂素的mRNA表達水平無明顯差異，見圖4。在重度PE組中，足月患者的VF mRNA表達量為3.09±1.93，未足月妊娠患者的VF mRNA表達量為2.15±0.75，二者比較無明顯差異。

Figure 4.The mRNA expression of visfatin in the placenta of patients with preeclampsia determined by real－time PCR.The data were expressed relative to GAPDH expression.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normal pregnancy group.圖4 3組內脂素mRNA的相對表達量

討論

1 血管內皮細胞損傷和功能紊亂在子癇前期中的作用

子癇前期是妊娠期特有的疾病，目前我國發病率為3%～5%。其主要臨床表現為高血壓、蛋白尿、水腫，基本病理變化是全身小血管痙攣［1］。多數病例終止妊娠、胎盤娩出后臨床癥狀逐漸緩解或消失，表明子癇前期的病因在胎盤。既往研究認為子癇前期的發病機制為胎盤淺著床、氧化應激、血管緊張素II受體－1自身抗體形成、血小板和凝血酶原活化、血管內炎癥、內皮細胞損傷及功能紊亂，其中血管生成失衡被認為是最重要的原因［4］。本研究通過對胎盤進行HE染色觀察證實:正常妊娠孕婦絨毛結構清晰完整，絨毛毛細血管未有損傷、淤血;隨著子癇前期的發展，絨毛結構逐漸破壞，同時絨毛毛細血管損傷、淤血也逐漸加重。以上結果表明絨毛血管內皮細胞損傷和功能紊亂是子癇前期的重要病因，同時也是判斷子癇前期嚴重程度的重要指標。

2 內脂素的高表達與子癇前期的相關性

脂肪組織不只是能量儲存器官，還是一個真正的內分泌器官，它可以分泌一系列生物活性因子，包括細胞因子及趨化因子類(腫瘤壞死因子α、白細胞介素、單核趨化蛋白1等)，血管活性因子及凝血因子類(血管緊張肽、纖維酶原激活物抑制劑等)，特異性脂肪因子類(瘦素、脂聯素、內脂素、抵抗素等)［5－7］。內脂素是日本學者Fukuhara等［3］于2005年發現的一種新型脂肪因子，蛋白質由473個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為5.2 kD，基因位于7號染色體q22.1和q31.33之間，長37.4堿基對，包含10個內含子和11個外顯子。既往研究認為內脂素在多種疾病中發揮重要作用:2型糖尿病和肥胖癥患者中血清內脂素與胰島素抵抗、慢性系統性炎癥、心血管疾病、內皮細胞功能紊亂密切相關［8］;抑制內脂素生成可減少主動脈粥樣硬化病灶形成并且減輕內皮細胞損傷［9］;腎透析患者血清內脂素與高敏感性C反應蛋白(血管死亡和動脈硬化的敏感指標)相關［10］;多囊卵巢綜合癥患者血清內脂素與血管功能紊亂有關［11］。以上研究表明內脂素可能作為生物性標志參與慢性炎癥反應及血管功能紊亂。妊娠所引發的機體適應性反應稱為亞炎癥狀態［12］，此時婦女血清內脂素水平高于未孕同齡婦女［13］，血清VF在中期妊娠期間達到巔峰，隨后稍有下降并在晚期妊娠期間保持相對穩定［14］。內脂素等炎癥因子的微小變化可能打破妊娠亞炎癥平衡從而誘導子癇前期等妊娠期并發癥。子癇前期患者存在血清內脂素的改變目前已經得到廣泛認可［15－17］，然而胎盤作為子癇前期的病因是否也存在內脂素水平的改變目前還存在爭議。現研究認為，胎盤VF水平與血清VF濃度無明顯相關性，這可能是因為VF并非是一種分泌性蛋白，其主要在局部通過旁分泌、自分泌的方式發揮作用［13］。本研究通過免疫組化法及real－time PCR技術檢測胎盤VF蛋白及mRNA表達證實:正常妊娠孕婦及子癇前期孕婦胎盤均有內脂素蛋白及mRNA的表達，隨著子癇前期程度的加重，胎盤VF蛋白及mRNA相對表達量逐漸升高。重度子癇前期組VF蛋白及mRNA均明顯高于正常妊娠組，差異有統計學意義。但是，重度子癇前期組中足月患者與未足月患者的胎盤VF蛋白及mRNA表達無明顯差異。以上結果顯示:晚期妊娠期間胎盤VF蛋白及mRNA含量保持相對穩定，可以認為此期間孕周對VF蛋白及mRNA含量影響不大;內脂素在子癇前期的發生、發展中起著重要作用，并且可以作為判斷子癇前期發展程度的重要炎癥性指標。既往研究認為，內脂素與前B細胞克隆增強因子同源，B細胞克隆增強因子可以調控B細胞分化成熟、調控細胞周期、延緩中性粒細胞凋亡從而參與炎癥、免疫應答及血管生成［18］;通過上調血栓素合成酶合成促進白細胞介素－8合成［19］;通過mTOR信號通路增強內皮細胞低氧誘導因子－1、血管內皮生長因子的表達［20］;通過NF－κB信號通路促進MMP－2、MMP－9和血管內皮生長因子的表達［21］。內脂素通過以上方式參與血管內皮細胞的增殖和血管的形成，導致血管生成紊亂。本研究發現隨著子癇前期程度的加重，胎盤VF蛋白及mRNA含量逐漸升高，這和絨毛毛細血管損傷、淤血保持一致趨勢，在一定程度上說明內脂素促使內皮細胞損傷和功能紊亂而誘發子癇前期的可能。與此同時，本實驗還發現輕度PE組與其它2組產婦胎盤VF蛋白及mRNA表達差異均無統計學意義，但表達量按正常組、輕度PE組和重度PE組呈階梯上升趨勢，推測有可能是VF升高需達一定閾值后才會出現內皮細胞損傷和功能紊亂，導致子癇前期的發生。總之胎盤VF蛋白及mRNA表達在子癇前期孕婦中是明顯升高的，其與子癇前期的發生具有相關性，但其具體作用機制尚有待大樣本進一步研究。

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Protein and mRNA expression of visfatin in placenta of patients with preeclampsia

WANG Jiang－ling1，CHEN Si－si1，TANG Jie1，WANG Si－lu2，WAN Li3，HUANG Yinping1

(1Department of Obstetrics，2Surgical Laboratory，3Department of Pathology，The First Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China.E-mail:yphuangy@126.com)

AIM:To investigate the expression of visfatin in the placenta of patients with preeclampsia and its significance.METHODS:The pregnant women(n=100)were divided into normal pregnancy group，mild preeclampsia group and severe preeclampsia group according to the severity of the disease.The pathological changes of the placenta were observed by hematoxylin－eosin staining.The expression of visfatin at mRNA and protein levels in the placenta was detected by real－time PCR and immunohistochemistry respectively.RESULTS:Compared with normal pregnancy group，the pathological changes of the placenta in preeclampsia groups was significant，showing that the structure and the form were disordered and incompleted in both cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts.The proliferation of cytotrophoblasts and the numbers of the placental villi with syncytial knots were observed.The vascular numbers of villi were decreased and congested.The results of immunohistochemistry and real－time PCR showed that the visfatin protein was observed in the cytoplasm of cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts among 3 groups.The expression of visfatin at mRNA and protein levels was increased with the severity of the preeclampsia.CONCLUSION:The injury and dysfunction of vascular endothelial cells in the villi exist in the patients with preeclampsia.High expression of visfatin at mRNA and protein levels in placenta of the patients with preeclampsia indicates that visfatin is closely related to preeclampsia.

Preeclampsia;Placenta;Visfatin;Endothelial cell injury

R714.24+4

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.026

1000－4718(2015)02－337－06

2014－09－29

2014－12－05

溫州市科技局資助項目(No.Y20110256)

△通訊作者Tel:0577－88069304;E－mail:yphuangy@126.com