NMR測定丹酚酸B標準品中有機溶劑殘留*

許 磊 ，王 萌 ，王躍飛 ，姜苗苗

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津國際生物醫藥聯合研究院，中藥新藥研發中心，天津 300457）

NMR測定丹酚酸B標準品中有機溶劑殘留*

許 磊1，2，王 萌1，王躍飛1，姜苗苗1

（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津國際生物醫藥聯合研究院，中藥新藥研發中心，天津 300457）

[目的]用定量核磁共振（QNMR）技術建立中藥來源的標準品化合物丹酚酸B中殘留甲醇、乙醇和乙酸含量的快速分析方法。[方法]采用BRUKERAVANCEⅢ600型超導核磁共振波譜儀采集譜圖，觀頻率600.23MHz，測定溫度298 K。譜寬12 019.2 Hz，采樣數據點65 536，掃描次數16次，延遲時間15 s。[結果]所有標準曲線在1.22～2 430mg/L范圍內線性良好（r2＞0.999 5)，平均回收率（n＝6）在105%～109%之間。[結論]本方法快速、準確，可應用于樣品有機溶劑殘留的檢測。

液體核磁共振；有機溶劑殘留；丹酚酸B；定量分析

中藥標準品化合物，是指中藥中特征的化學成分或有效的化學物質，在中藥產品的質量控制規范和方法中，作為定量控制的標準參照化合物[1]。中藥標準品化合物純度是中藥產品的質量控制的關鍵。在中藥標準品的生產制備過程中，常使用大量的有機溶劑進行提取、分離和純化，導致標準品中不可避免存在有機溶劑殘留。因此，有機溶劑殘留分析是中藥的標準品生產制備的重要環節。目前，有機溶劑殘留量檢測普遍采用氣相色譜法[2-5]。但其操作復雜、耗時，未知樣品難以判斷其殘留有機溶劑種類，對于甲酸、乙酸等不易揮發溶劑響應較差，而且儀器精密度受溫度、壓力、流動相等因素影響大。

近年來，儀器裝置長足發展，核磁共振已經成為強有力的分析工具，在藥物分析領域受到廣泛關注[6-8]。核磁共振波譜用于定量分析不需要為每一種被測物選擇相應的標準品。中藥標準品分離困難，價格昂貴，不易獲得，而核磁共振波譜不破壞樣品，樣品可以反復利用。可以同時對有機溶劑定性定量分析，利用核磁共振波譜分析具有優勢。

丹參為傳統中藥，具有舒張血管、保護心肌、抗氧化、抗凝和保護內皮細胞的多種功效[9-10]，丹酚酸B是丹參的主要水溶性成分，具有多方面的藥理活性[11-14]，常作為評價丹參質量的指標性成分。在其分離純化過程中常使用甲醇、乙醇、乙酸等有機溶劑，該實驗以丹酚酸B為研究對象，運用定量核磁共振技術（QNMR）建立丹酚酸B中甲醇、乙醇、乙酸殘留的檢識方法，具有操作簡便、分析時間短、不破壞樣品、無偏向性等優點，滿足藥物有機溶劑殘留的檢測，可為建立其他中藥標準品中機溶劑殘留量的檢測提供科學依據。

1 儀器及試劑

BRUKERAVANCEⅢ600型超導核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司），質子激發頻率600.23MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數字控溫儀。5mm標準核磁樣品管（美國NORELL公司）。D2O（氘代度 ＞ 99.8%，美國 NORELL 公司）；3－（三甲基甲硅烷）丙酸－d4鈉鹽（TSP，氘代度 ＞98%，美國 Sigma－Aldrich公司）；甲醇（≥99.5%）、乙醇（≥99.7%）、冰乙酸（≥99.5%）（均購自天津市大茂化學試劑廠）；丹酚酸B標準品（中新藥業）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 分別稱取甲醇、乙醇和乙酸適量，精密稱定，置容量瓶中，加D2O（含內標TSP 0.2 g/L）溶液稀釋至刻度，得到甲醇濃度為0.84 g/L，乙醇濃度為0.078 g/L，乙酸濃度為2.43 g/L。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取供試品10mg，加入0.5mLD2O（含內標TSP 20 g/L），轉移至5mm核磁管中，直接用于1H-NMR測試。

2.2 分析方法 采用30°脈沖序列zg30采集樣品溶液的1H-NMR圖譜。測定溫度298 K，觀測頻率600.23MHz，譜寬 12 019.2Hz，90°脈沖寬度 13 μs，采樣數據點65 536，掃描次數16次，延遲時間15 s，接受增益128。用TSP信號定標。

2.3 殘留溶劑分析 核磁共振定性鑒定和定量分析可同步完成，定性鑒定有機溶劑無須標準樣品，利用譜圖化學位移、耦合常數、質子數以及NMR數據[15]，鑒定了樣品中甲醇、乙醇和乙酸信號峰，見圖1。

QNMR用于定量分析的基礎是各化學環境中的質子吸收峰的面積只與所包含的質子數有關，不需引進任何校正因子就可直接根據各共振峰的積分值推算所代表的自旋核的數量[16]。定量的樣品峰應選擇無其他共振峰干擾。故選擇δ3.34處單峰為甲醇定量峰，δ1.19處峰為乙醇定量峰，δ1.94處峰為乙酸定量峰，見圖1。

圖1丹酚酸B的一維1H-NMR譜圖Fig.1 Representative1D 1H-NMR spectraofSalvianolicacid B

2.4 線性關系和范圍 精密移取對照品貯備液，加D2O溶液配制為7個標準濃度備用。分別精密量取0.5mL于5mm核磁管中，記錄NMR氫譜圖。以標準濃度X（g/L）對定量峰與內標物峰積分面積之比Y進行線性回歸，得到3種被測物質的標準曲線和相關系數分別是甲醇：Y=8.934X+0.812 6 （r2＝0.999 6）；乙醇：Y＝5.709 4X＋0.041 5（r2＝0.999 8）；乙酸：Y＝5.023 9X＋0.005 8（r2＝1）。

結果表明，甲醇進樣量在13～840mg/L，乙醇進樣量在1.22～78.3mg/L，乙酸進樣量在38～2 430mg/L內線性關系良好。

2.5 精密度實驗 取對照品溶液0.5mL，連續測試6次，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積計算，RSD（n＝6）分別為 1.02%、0.64%和 0.38%，精密度良好。

2.6 重復性實驗 取丹酚酸B共6份，精密稱定，在上述條件下進行測定，以甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積計算，RSD（n＝6）分別為1.52%、1.34%和0.88%，重復性良好。

2.7 穩定性實驗 取供試品溶液0.5mL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 測定，甲醇、乙醇和乙酸定量峰峰面積的 RSD（n＝6）分別為 1.21%、1.15%和 0.78%，供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 樣品測定和標準加入回收率 取供試品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下分析條件，計算各樣品有機溶劑的殘留量。計算含量結果見表1。樣品的典型1H-NMR圖譜見圖1。

向供試品加入已知濃度的3種殘留有機溶劑的標準液，在最佳條件下測得3種殘留有機溶劑的加標回收率（n＝6）分別為 108.2%（甲醇）、107.3%（乙醇）、105.6%（乙酸）。結果表明，本方法適用于丹酚酸B標準物質有機溶劑殘留測定。

表1樣品分析結果Tab.1 Determ ination resultsof sam ples %

3 討論

為了獲得準確的定量結果，實驗中考察了3種不同脈沖序列（zg30，zg，zgcppr）對定量結果影響，其他條件與上述相同。分別用3種脈沖序列測定已知濃度的有機溶劑標準物的含量，結果以zg30和zg脈沖序列測試1H-NMR圖譜峰行較好，定量準確，而zgcppr壓制水峰序列對測定影響較大，這可能是由于該序列容易引起信號峰畸變對其他信號峰也有較大影響。zg為90°脈沖，小角度脈沖zg30可在較短時間內獲得充分弛豫[17]，節省檢測時間，因此優選zg30為實驗測試序列。

核磁共振定量，通過比較被測樣品定量峰與內標物質響應峰峰面積，即可以對被測物進行定量。本實驗以3-（三甲基甲硅烷）丙酸-d4鈉鹽（TSP）為內標物，在D2O中有良好的溶解度，與D2O和待測物互相不反應。TSP的響應峰值在δ0，與被測物具有良好分離度，因此被選擇為內標物。

有機溶劑殘留檢測屬于標準品化合物的純度測定范圍，現行中藥準品化合物的純度鑒別主要以高效液相色譜（HPLC）法為主，而HPLC法難以鑒別有機溶劑殘留問題，影響中藥質量控制。有機溶劑殘留測定多采用氣相色譜法，對于乙酸等不易揮發溶劑使用氣相色譜法，基本沒有頂空進樣方式的響應信號[18]，直接進樣則容易導致樣品中非揮發性物質對色譜柱的污染與損害[19]，影響有機溶劑定性。采用QNMR方法測定樣品溶劑殘留，在同一張圖譜上，可對中藥主要物質與其殘留溶劑進行定性定量分析，具有快速、簡便、準確、專屬性高的特點，能滿足有機溶劑殘留的分析要求。

[1]邱明華.中藥標準品化合物的純度和標準化[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2005,S1:91-97,112.

[2]張在娟,逯 荻,崔麗霞,等.頂空進樣氣相色譜法測定腦脈通軟膠囊中有機溶劑殘留量[J].天津中醫藥,2011,28(6):506-509.

[3]樊春艷,張 沂,劉秀芳,等.GC法測定鹽酸法舒地爾中有機溶劑殘留量[J].解放軍藥學學報,2014,30(2):165-166,169.

[4]Pavlovi AD,Ignjatovi LM,Popov SZ,et al.Application of gas chromatography analysis to quality control of residual organic solvents in clopidogrel bisulphate[J].JSerb Chem Soc,2014,79(10):13-13.

[5]Saraji M,Khayamian T,Siahpoosh ZH,et al.Determination of volatile residual solvents in pharmaceutical products by static and dynamic headspace liquid-phasemicroextraction combined with gas chromatography-flame ionization detection[J].AnalMethods,2012,4(6):1552-1559.

[6]Malet-Martino M,Holzgrabe U.NMR techniques in biomedicaland pharmaceutical analysis[J].J.Pharm Biomed Anal,2011,55(1):1-15.

[7]劉 陽,周 穎,張才煜,等.核磁共振定量法測定脒基吡唑含量[J].藥物分析雜志,2014,34(6):1087-1090.

[8]劉英華,王 婧,劉振軍.核磁共振法快速檢測肝素鈉粗品[J].分析科學學報,2013,29(4):590-592.

[9]高秀梅,張伯禮,宮 濤,等.丹參及提取物對心血管系統藥理作用研究進展[J].天津中醫藥,2002,19(1):74-76.

[10]范英昌,金樹梅,趙桂峰.丹參酮ⅡA對EVC304細胞血管舒縮因子的影響[J].天津中醫藥大學學報,2006,25(4):215-218.

[11]呂炳強,范英昌,孫連勝.丹酚酸B、丹參酮IIA對動脈粥樣硬化家兔血清一氧化氮及甘油三酯的影響[J].天津中醫藥大學學報,2006,25(1):32-34.

[12]范英昌,華聲瑜,郭茂娟,等.丹酚酸B干預骨髓間充質干細胞移植對AMI大鼠心梗區血管新生的影響[J].天津中醫藥大學學報,2007,26(3):133-136.

[13]華聲瑜,趙桂峰,李慶雯,等.丹酚酸B預處理EPCs對AMI大鼠移植骨髓間充質干細胞后心肌微環境的影響[J].天津中醫藥,2012,29(2):117-120.

[14]華聲瑜,范英昌,馬軼文,等.丹酚酸B對大鼠骨髓間充質干細胞分化過程中Desmin、α-actinmRNA表達的影響[J].天津中醫藥,2009,26(2):145-148.

[15]Fulmer GR,Miller AJ,Sherden NH,et al.NMR chemical shifts of trace impurities:common laboratory solvents,organics,and gases in deuterated solvents relevant to the organometallic chemist[J].Organometallics,2010,29(9),2176-2179.

[16]Holzgrabe U,Deubner R,Schollmayer C,et al.Quantitative NMR spectroscopy-applications in drug analysis[J].Journal of pharmaceutical and biomedicalanalysis,2005,38(5):806-812.

[17]Malz F,Jancke H.Validation of quantitative NMR[J].JPharm Biomed Anal,2005,38(5):813-823.

[18]陸 燁,夏宇沁,昌 軍,等.毛細管氣相色譜法測定13種有機溶劑殘留[J].復旦學報(醫學版),2013,40(2):222-226.

[19]Smith ID,Waters DG.Determination of residual solvent levels in bulk pharmaceuticals by capillary gas chromatography[J].Analyst,1991,116(12):1327-1331.

Determ ination of the residualorganic solvents in Salvianolic acid B by NMR

XU Lei1,2，WANGMeng1，WANGYue-fei1，JIANGMiao-miao1
（1.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin University of TraditionalChineseMedicine,Tianjin 300193,China；2.Research and DevelopmentCenterof TraditionalChineseMedicine,Tianjin International JointAcademyofBiotechnology and Medicine,Tianjin 300457,China）

[Objective]To establish an QNMRmethod for the determination ofmethanol,ethanoland acetic acid in Salvianolic acid B.[Methods]The1H-NMR spectrawasperformed on a Bruker AVⅢ600MHz NMR spectrometerwith a proton frequency of600.23MHz and a temperatureof298K.[Results]Each experimentconsisted of16 scanswith a spectralwidth of12 019.2Hzand a recycle delay of 15 sper scan.All the calibration curvesshowed good linearity(r2>0.999 5)in the rangeof1.22～2 430mg/L.The average recoverieswere 105%～109%（n=6）.[Conclusion]Themethod is rapid and accurate,which is helpful for the determination of the residua1 organic solvents in Salvianolic acid B.

liquid NMR;residua1 organic solvent;Salvianolic acid B;quantitative analysis

R285.5

A

1672-1519（2015）08-0501-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.08.15

國家自然科學基金項目（81303181）。

許 磊（1989－），男，碩士研究生，主要從事中藥化學物質基礎研究。

姜苗苗，E-mail：miaomiaojiang@126.com。

2015-01-05）

p