1873例結核感染T細胞斑點試驗檢測陽性患者的臨床分析

張娟 孫嬌 李瑩 王悅 孫秀華 馬靜紅 邢黎莉 譚珂 彭嬌 孫炳奇

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·論著·

1873例結核感染T細胞斑點試驗檢測陽性患者的臨床分析

張娟 孫嬌 李瑩 王悅 孫秀華 馬靜紅 邢黎莉 譚珂 彭嬌 孫炳奇

目的 探討結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測結果與結核病患者臨床表現的相關性。方法 選取臨床確診結核病且T-SPOT.TB檢測陽性患者1873例，并從患者的基本情況、細菌學、影像學及常規檢查等4個方面對T-SPOT.TB檢測結果[SFCs(個)/106PBMCs]與結核病患者臨床表現的相關性進行比較分析。結果 初治患者外周血單核細胞(PBMCs)中斑點形成細胞 (SFCs)數 [A孔中位數17個，B孔中位數13個]明顯高于復治患者[A孔中位數9個，B孔中位數9個] (A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)；中青年患者SFCs數[A孔中位數17個，B孔中位數12個]明顯高于老年患者[A孔中位數9個，B孔中位數9個](A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)；菌陽患者的SFCs數[A孔中位數27個，B孔中位數20個]明顯高于菌陰患者[A孔中位數10個，B孔中位數10個](A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)；肺部有空洞的患者SFCs數[A孔中位數32個，B孔中位數25個]明顯高于肺部無空洞的患者[A孔中位數10個，B孔中位數9個](A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)；外周血單核細胞升高的患者SFCs數[A孔中位數21個，B孔中位數20個]明顯高于外周血單核細胞正常的患者[A孔中位數10個，B孔中位數9個](A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)。結論 T-SPOT.TB的SFCs計數雖然并不能完全與結核病活動程度呈正相關，但仍然存在著結核病活動程度越高SFCs數越多的趨勢。

潛伏性結核/診斷； 酶聯免疫斑點測定

結核病是危害人類生命健康的主要疾病之一，是當今世界單一致病菌引起死亡率最高的疾病，占世界總死亡率的第七位。直到今天，全球結核病仍呈持續蔓延之勢[1]。因此，快速準確地診斷結核病及有效控制結核病的蔓延成為至關重要的問題。近年來γ-干擾素釋放試驗 (interferon gamma release assay，IGRA)方法之一的結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測技術，因其高特異度和高敏感度越來越廣泛地應用于結核病[尤其是潛伏性結核感染(LTBI)]的臨床診斷，但是卻很少有報告探討T-SPOT.TB 檢測外周血單個核細胞(PBMCs)中斑點形成細胞 (SFCs)數[SFCs(個)/106PBMCs]與臨床癥狀的相關性。本研究對結核病患者T-SPOT.TB 檢測結果與臨床癥狀的相關性進行探討，希望此項檢測結果能夠為臨床診治提供更多的參考依據。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析本院2013年8月至2014年8月臨床確診為結核病、且T-SPOT.TB檢測陽性的患者1873例，平均年齡(49.67±18.72)歲；其中男1156例，平均年齡(50.60±18.18)歲；女717例，平均年齡(48.18±19.49)歲。所有患者均排除糖尿病、艾滋病等免疫系統缺陷性疾病。

二、分組方法

肺結核并發癥、初治和復治、肺結核和肺外結核、菌陰和菌陽結核病患者分組標準均參照《肺結核診斷和治療指南》[2]。本研究涉及的單核細胞正常值為(0.1～0.6)×109/L，淋巴細胞正常值為(1.1～3.2)×109/L。

三、T-SPOT.TB試驗

應用上海復星醫藥科技有限公司提供的結核感染T細胞斑點診斷試劑盒，按試劑盒說明書進行檢測判斷結果。其中A孔和B孔為平行檢測孔，A孔內包被早期分泌性靶抗原6 (early secretory antigenic target 6，ESAT-6)，B孔內包被培養濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)抗原。結果判讀：空白對照孔內SFCs<10個且陽性對照孔內SFCs>20個時視為實驗有效。當ESAT-6或CFP-10任一檢測孔達到以下標準則判定為陽性結果：①如果空白對照孔SFCs<5個，檢測孔SFCs減去空白對照孔SFCs≥6個。②如果空白對照孔SFCs≥6個，檢測孔SFCs必須>2倍的空白對照孔SFCs。

四、統計學分析

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，偏態分布的計量資料以中位數和上下四分位數表示，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，組內比較采用Wilcoxon秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同人群外周血T-SPOT.TB檢測結果

表1所示，在全體患者中，有1219例初治患者，654例復治患者，初治患者的A孔和B孔SFCs顯著高于復治患者，且差異有統計學意義(A孔U=364 391.5，P<0.01；B孔U=364 259.0，P<0.01)，而男性和女性之間差異無統計學意義(A孔U=414 760.0，P>0.05；B孔U=416 904.5，P>0.05)。中青年(16～60歲)A孔和B孔SFCs顯著高于老年(>60歲)組，差異具有統計學意義(A孔U=304 368.5，P<0.01；B孔U=302 802.0，P<0.01)。

二、肺結核組與肺外結核組外周血T-SPOT.TB檢測結果

表2所示，在1873例患者中，有1498例肺結核患者，375例肺外結核患者，肺結核組與肺外結核組A孔和B孔SFCs差異無統計學意義(A孔U=279 633.0，P>0.05；B孔U=288 622.0，P>0.05)。

表1 不同患者外周血T-SPOT.TB檢測結果

注 表1 中年齡分組未包括小兒患者，因為該組患者只有9例，樣本數太少，故未單獨進行數據統計

表2 肺結核組與肺外結核組外周血T-SPOT.TB檢測結果

三、菌陰與菌陽結核病組外周血T-SPOT.TB檢測結果

表3 所示，在1873例患者中，有1549例患者進行了細菌學檢查，其中1067例菌陰患者，482例菌陽患者。菌陽患者A孔和B孔斑點中位數分別為27和20個，顯著高于菌陰組的10和10個，差異有顯著統計學意義(A孔U=298 504.0，P<0.01；B孔U=279 815.5，P<0.01)。

四、結核病患者有無并發癥的外周血T-SPOT.TB檢測結果

如表4所示，在1873例患者中，合并呼吸衰竭等并發癥的患者為110例，但結核病患者有無并發癥并未對T-SPOT.TB檢測的SFCs造成明顯影響，兩組間差異無統計學意義((A孔U=104 122.0，P>0.05；B孔U=92 436.5，P>0.05)。

五、結核病影像學所見有無空洞和鈣化患者的外周血T-SPOT.TB檢測結果

表5所示，在1873例患者中，有323例患者肺部影像學顯示有空洞，空洞組患者SFCs顯著高于無空洞組，差異有顯著統計學意義(A孔U=208 015.5，P<0.01；B孔U=216 424.5，P<0.01)。鈣化組與無鈣化組患者間比較，差異無統計學意義(A孔U=175 777.0，P>0.05；B孔U=192 415.0，P>0.05)；而鈣化<3年組患者的SFCs明顯多于鈣化>3年組，其中A孔的結果兩者差異無統計學意義(A孔U=3180.0，P>0.05)，B孔的結果兩者差異有統計學意義(B孔U=28 805.0，P<0.05)。

六、血常規是否異常患者的外周血T-SPOT.TB檢測結果

表6所示，1867例患者進行血常規檢測，單核細胞絕對值升高的患者523例，單核細胞絕對值正常患者1341例，單核細胞絕對值降低患者僅3例，無法進行統計學分析。淋巴細胞絕對值升高者32例，淋巴細胞絕對值正常者1459例，淋巴細胞絕對值降低者376例。單核細胞升高組A孔和B孔SFCs均明顯高于單核細胞正常組，差異有顯著統計學意義(A孔U=308 522.0，P<0.01；B孔U=307 748.0，P<0.01)；而淋巴細胞異常組中僅有淋巴細胞降低組A孔與正常組相比差異有統計學意義(U=249 017.0，P<0.01)。

表3 菌陰與菌陽結核病組外周血T-SPOT.TB檢測結果

表4 結核病患者有無并發癥的外周血T-SPOT.TB檢測結果

表5 結核病影像學所見有無空洞和鈣化患者的外周血T-SPOT.TB檢測結果

表6 血常規是否異常患者的外周血T-SPOT.TB檢測結果

七、同組內A孔和B孔SFCs中位數比較

表7所示，對于同組內樣本的A孔和B孔SFCs進行比較，采用Wilcoxon秩和檢驗，只有有鈣化組患者的A孔和B孔間差異有統計學意義(Z=-2.141，P<0.05)，其他組內A孔和B孔SFCs差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

表7 同組內A孔和B孔SFCs中位數比較

討 論

酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)技術是近年來發展起來的一種細胞因子檢測技術[3]。目前研究認為T-SPOT.TB技術能夠較敏感地診斷出LTBI[4-8]，然而T-SPOT.TB診斷結果與結核病患者臨床表現之間是否具有一定的相關性[9]，目前尚無深入研究。本研究回顧性分析了1873例T-SPOT.TB陽性的結核病臨床確診患者，并從患者的基本情況、細菌學、影像學及常規檢查4個方面分析了T-SPOT.TB檢測結果與結核病患者臨床表現之間的相關性。

本研究發現，初治患者SFCs顯著高于復治患者 (P<0.01)，可能由于復治結核病患者的免疫功能受到抑制，T淋巴細胞免疫應答能力下降。且復治結核病患者隨著病情進展，機體細胞免疫功能進一步下降，并逐步缺乏相應的免疫效應，細胞激活或免疫抑制進一步加重，減弱了T淋巴細胞亞群對結核分枝桿菌的殺滅作用。在對中青年組與老年組的比較發現，中青年組A孔和B孔SFCs均顯著高于老年組 (P<0.01)，可能是與老年患者免疫功能低下，尤其是免疫屏障功能降低(T淋巴細胞增殖及活性降低)有關。由此表明，盡管以前的研究認為T-SPOT.TB檢測結果受受試者免疫狀態影響較小[10-11]，但在應用此項技術時，也應盡量考慮到受試者的免疫因素干擾[12]。

在分析的1873例患者中，其中有1549例患者進行細菌學檢查，482例菌陽患者A孔和B孔SFCs數顯著高于菌陰組(1067例)(P<0.01)，表明T-SPOT.TB檢測的SFCs數高低與患者的荷菌量有一定關系，這與以往的一些報道是一致的[13-14]。Tsao等[15]發現高細菌負荷肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中IFN-γ水平最高，因此認為IFN-γ是局部炎性部位的細菌負荷標志物。本研究結果顯示，患者T-SPOT.TB 檢測的SFCs隨著痰菌數量增加而上升，這與其他學者的研究結果是一致的。國外文獻報道，痰菌陽性程度與T-SPOT.TB檢測的SFCs數高低有關[16]。有學者分別對結核感染患者在結核感染治療的最初2周內、治療結束時及治療結束6個月后進行T-SPOT.TB及產生特異性抗原的外周血單核細胞數(即SFCs數)的檢測，結果顯示隨著治療的深入，T-SPOT.TB的陽性率降低，陽性患者的SFCs數呈下降趨勢[17]。然而，也有一些研究認為，細菌負荷量與T-SPOT.TB檢測結果呈負相關，即高菌負荷的肺結核患者的外周血T淋巴細胞在受到特異性結核抗原刺激后存在產生IFN-γ缺陷[18-19]。總之，肺結核患者外周血和BALF中的T-SPOT.TB 聯合檢測對于評估肺結核嚴重程度將有更大的臨床意義。

本研究中，肺部影像學顯示有空洞的患者323例，T-SPOT.TB檢測結果的SFCs數顯著高于無空洞組，這與一些學者研究的結果是相反的。Dlugovitzky等[20]比較肺結核不同程度病變范圍與IFN-γ水平的關系，發現重度肺結核患者的IFN-γ水平顯著低于中度肺結核患者。也有研究顯示空洞肺結核患者的IFN-γ釋放水平與無空洞肺結核患者比較差異無統計學意義，并且認為空洞是否出現是感染細菌的數量、毒力及機體免疫功能共同作用的結果，結核分枝桿菌的毒力或許對空洞形成的影響更大[18]。因此，我們尚需進行進一步研究，來檢測機體免疫細胞的功能。本研究肺部影像學存在鈣化的患者為217例，其中鈣化<3年的患者T-SPOT.TB結果顯著高于鈣化>3年的患者(P<0.05)。這在一定程度上說明了當結核病處于活動期時，T-SPOT.TB 檢測的SFCs數會在一定程度上呈上升趨勢，T-SPOT.TB檢測SFCs可以作為結核病是否處于活動期的一個輔助診斷指標。

在機體介導的細胞免疫反應中，單核巨噬細胞是結核分枝桿菌的主要棲居地，也是宿主抗原提呈細胞和抗菌的主要效應細胞；而淋巴細胞是主要的免疫調控細胞，因此，從PBMC研究結核病發病的機體免疫機制具有重要的意義。本研究從血常規檢測結果中發現，單核細胞升高組的患者其T-SPOT.TB檢測的SFCs數顯著高于單核細胞正常組(P<0.01)，這可能與單核細胞的生理功能有關。單核細胞是巨噬細胞的前身，能吞噬、清除受傷衰老的細胞及其碎片；另外還參與免疫反應，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉交給淋巴細胞，誘導淋巴細胞的特異性免疫反應[21]。由于單核細胞是結核感染免疫的重要起始和效應細胞，因此在活動性結核病中，單核細胞數量會明顯上升，這與單核細胞升高組進行T-SPOT.TB檢測的SFCs數較高的結果是一致的。另外，淋巴細胞降低組T-SPOT.TB檢測的A孔SFCs數明顯低于正常組(P<0.01)，這可能是由于結核感染免疫時淋巴細胞大量聚集于結核感染病灶，造成外周循環中淋巴細胞數量下降，活性T淋巴細胞數量減少，最終導致T-SPOT.TB檢測的SFCs數較少。

此外，本研究肺結核與肺外結核患者進行T-SPOT.TB檢測的SFCs數差異無統計學意義，可能是與檢測所用的標本類型有關。本回顧性分析的所有T-SPOT.TB檢測數據均來源于外周血，而對于肺外結核來說，對其他類型的標本進行檢測往往更有意義[22]。例如，對疑似結核性腹膜炎患者的腹腔積液進行檢測，對于結核性胸膜炎患者的胸腔積液進行檢測。因此，尚需要對相關類型的標本進行T-SPOT.TB檢測來進一步研究后得出結論。

本研究還對同組內T-SPOT.TB檢測結果的A孔和B孔SFCs數進行了比較，結果發現除了鈣化組之外，其他組內A孔和B孔SFCs數差異均無統計學意義。因此，本研究并未發現人群對CFP-10和ESAT-6兩種抗原反應性T-SPOT.TB檢測結果的差異有統計學意義，應繼續擴大樣本量加以證實。

總之，本研究發現T-SPOT.TB檢測的SFCs數雖然并不完全與結核病活動程度呈正相關，但仍然存在著結核病活動程度越高SFCs數越多的趨勢。

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(本文編輯：薛愛華)

Clinical analysis of positive T-SPOT.TB in 1873 cases with active tuberculosis

ZHANG Juan, SUN Jiao, LI Ying, WANG Yue, SUN Xiu-hua, MA Jing-hong, XING Li-li, TAN Ke, PENG Jiao, SUN Bing-qi.

Tuberculosis Laboratory, Shenyang Chest Hospital, Shenyang 110044, China

SUN Bing-qi，Email:Sunbq2004@163.com

Objective To explore the relationship between the spot-forming cells (SFCs) of T-SPOT.TB and clinical manifestation of tuberculosis. Methods One thousand eight hundred and seventy three patients with active tuberculosis and T-SPOT.TB positive result were enrolled in this study. The correlation between T-SPOT.TB results and clinical manifestations of tuberculosis patients was compared and analyzed based on the demographic data, bacteriology，imaging characteristics and blood routine examination. Results The median of SFCs of T-spot in primary patients (A:17，B:13)was significantly higher than that of retreatment patients(A: 9，B: 9) (Uvalue of A was 364 391.5，P<0.01；Uvalue of B was 364 259.0，P<0.01)；The median of SFCs of T-spot in young to middle-aged patients (A:17，B: 12)was significantly higher than that in the elderly patients (A: 9，B: 9)(Uvalue of A was 304 368.5，P<0.01；Uvalue of B was 302 802.0，P<0.01)；The median of SFCs of bacteriology positive patients (A: 27，B: 20)was significantly higher than that of bacteriology negative patients(A: 10，B: 10)(Uvalue of A was 298 504.0，P<0.01；Uvalue of B was 279 815.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with cavity in lung(A: 32，B: 25) is higher than that in patients with no cavity in lung(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 208 015.5，P<0.01；Uvalue of B was 216 424.5，P<0.01)；The median of SFCs of patients with higher mononuclear cells (A: 21，B: 20)was significantly higher than that in patients with normal mononuclear cells(A: 10，B: 9)(Uvalue of A was 308 522.0，P<0.01；Uvalue of B was 307 748.0，P<0.01). Conclusion SFCs of T-SPOT.TB cannot be related with tuberculosis activity, but the trends of more high tuberculosis activity level accompany with more SFCs can be found.

Latent tuberculosis/diagnosis； Enzyme-linked immunospot assay

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.013

沈陽市科技計劃項目(F12-255-1-00)

110044 沈陽市胸科醫院結核病實驗室

孫炳奇，Email：Sunbq2004@163.com

2015-02-11)