三種方法進行結核分枝桿菌-乙胺丁醇藥物敏感性試驗的比較

孫慶 趙麗麗 陳燕 趙秀芹 吳移謀 萬康林

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·論著·

三種方法進行結核分枝桿菌-乙胺丁醇藥物敏感性試驗的比較

孫慶 趙麗麗 陳燕 趙秀芹 吳移謀 萬康林

目的 比較3種以細菌培養為基礎的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)方法檢測結核分枝桿菌對乙胺丁醇的藥物敏感性。方法 采用改良羅氏培養基比例法(L-J法)、 Bactec MGIT 960檢測系統法(960法)和微孔板Alamar blue顯色法[最低抑菌濃度法(MIC法)]同步對126株結核分枝桿菌臨床分離株進行乙胺丁醇藥敏試驗，比較分析3種方法的藥敏試驗結果。試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行分析處理。Kappa值在0.4～0.75為一致性較好，Kappa值≥0.75為一致性極佳，Kappa值<0.4為一致性差。結果 3種方法總體一致率為75.4%(95/126)。若以L-J法測定結果為判斷標準，則960法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為62.8%(49/78)、100.0%(48/48)、77.0%(97/126)和82.1%(64/78)、97.9%(47/48)、88.1%(111/126)，MIC法與L-J法一致性極佳(Kappa=0.76)，而960法與L-J法比較顯示一致性較好(Kappa=0.56)。若以960法測定結果為判斷標準，則L-J法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為100.0%(49/49)、62.3%(48/77)、77.0%(97/126)和98.0%(48/49)、77.9%(60/77)、85.7%(108/126)，L-J法和MIC法均顯示與960法有較好一致性(Kappa≥0.70)。若以MIC法測定耐藥結果為判斷標準，則L-J法和960法的敏感度、特異度和一致率分別為98.5%(64/65)、77.0%(47/61)、88.1%(111/126)和73.8%(48/65)、98.4%(60/61)、85.7%(108/126)。3種方法的不一致性主要表現在MIC值4.0～16.0 μg/ml的藥物濃度范圍。結論 3種方法對乙胺丁醇進行藥敏試驗具有較好的一致性，但也存在一定差異。L-J法和960法均與MIC法具有較高一致性，且MIC法性價比更高，適于耐乙胺丁醇結核病的早期診斷。

結核分枝桿菌； 乙胺丁醇； 微生物敏感性試驗

近年來，全球耐藥結核病的發病率呈上升態勢[1-2]，已嚴重威脅著人類的身體健康，結核分枝桿菌的耐藥問題也成為全球關注的熱點問題。耐藥結核病主要是由于濫用抗生素和不規范治療引起[3-4]；因此，合理的臨床治療對于控制耐藥結核病極為重要，快速、準確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)是制定合理有效的個體化抗結核化療方案的關鍵。目前，主要的結核病藥敏試驗有常被用作診斷耐藥金標準的羅氏培養基比例法(L-J法)，快速診斷耐藥結核病的 Bactec MGIT 960檢測系統法(簡稱“960法”)及快速、經濟的微孔板Alamar blue顯色法[最低抑菌濃度法(MIC法)]，等等[5-6]。這些藥敏試驗方法在現階段實驗室均有應用，然而大量的文獻表明其檢測結果存在一定的差異，其中對乙胺丁醇(EMB)的符合率最低[7-10]。因此，筆者分別比較了L-J法、960法及MIC法檢測結核分枝桿菌對于乙胺丁醇的藥敏試驗結果，并探討其符合率低的緣由。

材料和方法

一、菌株來源及試劑

1.菌株來源： 126株結核分枝桿菌臨床株及質控菌株H37Rv由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室傳代保存。

2.主要試劑：① EMB藥物純品，購自美國Sigma公司。② L-J法用改良羅氏培養基，按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》(下簡稱《規程》)配制[11]。③ Bactec MGIT 960 培養管及添加劑均由美國BD公司生產。④ Middlebrook 7H9培養基干粉、Middlebrook OADC(油酸、白蛋白、右旋糖和過氧化氫酶)購自美國BD公司。⑤ 阿爾瑪藍(Alamar blue)染料購自英國AbD Serotec公司，現配現用。⑥ McFarland標準比濁管由中國疾病預防控制中心傳染病所結核室提供。

3. 主要儀器設備：① 培養基蒸汽凝固箱：北京新中大業儀表公司生產。② Bactec MGIT 960系統：美國BD公司生產。③ 培養箱：上海一恒科技有限公司生產。

二、檢測方法

(一)培養基制備

(1) 改良羅氏培養基：按照《規程》進行，每組含2支不含藥物的對照培養基和2支含EMB藥物的試驗培養基(終濃度2 μg/ml)。(2)Bactec MGIT 960 培養基每組2支MGIT 培養管，加入0.8 ml OADC增菌劑，一支為對照管，一支為含藥管(EMB終濃度5 μg/ml)。(3) 7H9液體培養基每1000 ml由4.7 g 7H9干粉、2 ml甘油定容到900 ml蒸餾水中配制而成，于121 ℃高壓滅菌10 min后置4 ℃保存，臨用時加入100 ml OADC增菌劑。

(二)藥敏試驗

126株結核分枝桿菌分別用L-J法、960法、MIC法測試其對EMB的藥物敏感性。

1.菌懸液制備：在磨菌瓶內加入1～2滴5%吐溫-80，取菌齡2～3周的結核分枝桿菌新鮮培養物于磨菌瓶內，漩渦震蕩后靜置10～15 min，取上清加入生理鹽水配成1個麥氏比濁濃度[3×108菌落形成單位(CFU)/ml]。L-J法中，菌液加生理鹽水稀釋至3×104CFU/ml和3×102CFU/ml；960法中，菌液稀釋至0.5個麥氏濃度(1.5×108CFU/ml)；MIC法中，按文獻報道以1∶20用7H9培養基稀釋菌液[12]。

2.接種、孵育、顯色： ① L-J法：方法參照《規程》執行，對照培養基與含藥培養基分別接種3×102CFU/ml 和3×104CFU/ml菌液，37 ℃培養28 d后觀察結果。② 960法：分別取0.5 ml、1.5×108CFU/ml的菌液接種到對照管和含藥管中，裝入專用藥敏架中，掃描，置Bactec MGIT 960系統內孵育(37 ℃)。③ MIC法：參照文獻[10]和[13]，在96孔板中每孔加入100 μl 7H9培養基，第1列再加入98 μl 7H9及2 μl EMB溶液(51.2 mg/ml)，倍比稀釋至第11列，得到從256～0.25 μg/ml的藥物梯度，最后一列為空白對照；每株菌接種一行，每孔加入100 μl稀釋菌液，每批次均做H37Rv為陰性對照；另做一塊空白板(不含藥)，每孔加入100 μl 7H9培養基和100 μl 稀釋菌液，每株菌加4個孔；微孔板用封口膜密封；37 ℃溫箱孵育5 d。第6天開始在空白板每株菌的第1孔中加入70 μl顯色劑(Alamar blue∶5%吐溫-80=2∶5)，隔天觀察顏色變化情況，若顏色從藍色變成紫紅色或粉色，則在對應菌株的實驗板中每孔加入顯色劑顯色；若未變色或變色程度淺，則繼續在空白板的第2孔中加入顯色劑，直至變色(或至第4孔)為止。

3.結果判讀標準： ① L-J法：根據耐藥百分比判別，耐藥百分比=含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數×100%，若該比值大于1%，則判斷耐藥(R)，若該比值小于1%，則判斷為敏感(S)。② 960法：由Bactec MGIT 960系統根據生長單位指數統計，自動報告耐藥與敏感結果，WHO推薦的臨界濃度為5.0 μg/ml。③ MIC法： 藥物MIC被定義為藍色完全沒有發生改變的孔所對應的藥物濃度的最小值。耐藥界定濃度為EMB≥5.0 μg/ml[13]。

三、質量控制

每批藥敏試驗均用結核分枝桿菌標準株H37Rv(ATCC 27294)作為敏感對照。

四、數據分析

試驗數據采用SPSS 17.0軟件進行分析處理。Kappa值在0.4～0.75為一致性較好，Kappa值≥0.75為一致性極好，Kappa值≤0.4時為一致性差[14]。

結 果

一、EMB采用3種藥敏試驗方法檢測的結果

對126株結核分枝桿菌臨床分離株進行EMB

的藥敏試驗檢測，3種方法藥敏試驗結果均一致的菌株為95株，總體一致率為75.4%(95/126)。960法檢測耐藥的49株結核分枝桿菌分離株中，L-J法檢測均為耐藥，MIC法也僅1株檢測為敏感(MIC值為4.0 μg/ml)，其余均耐藥。結果的不一致性主要表現為16株L-J法和MIC法檢測為耐藥而960法檢測為敏感(51.6%，16/31)和13株菌株L-J法檢測為耐藥而960法和MIC法檢測為敏感(41.9%，13/31)。在不同MIC值，3種方法藥敏試驗結果一致率最低的位于MIC值為4.0～16.0 μg/ml的濃度梯度，僅為59.7%(43/72)；MIC值<4 μg/ml和>16.0 μg/ml的菌株中，3種方法一致率分別為94.7%(36/38)和100.0%(16/16)，一致性較好，見表1。各MIC值所對應L-J法和960法的一致率差異，可見二法差異性集中體現的MIC值范圍，見圖1。

圖1 EMB藥敏試驗各MIC值對應的L-J法和960法一致率

二、 EMB采用3種藥敏試驗方法檢測結果的比較

若以L-J法測定結果為判斷標準，則960法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為62.8%(49/78)、100.0%(48/48)、77.0%(97/126)和82.1%(64/78)、97.9%(47/48)、88.1%(111/126)(表2)。若以960法測定結果為判斷標準，則L-J法和MIC法的敏感度、特異度和一致率分別為100.0%(49/49)、62.3%(48/77)、77.0%(97/126)和98.0%(48/49)、77.9%(60/77)、85.7%(108/126)(表3)。若以MIC法測定耐藥結果為判斷標準，則L-J法和960法的敏感度、特異度和一致率分別為98.5% (64/65)、77.0%(47/61)、88.1%(111/126)和73.8%(48/65)、98.4%(60/61)、85.7%(108/126)(表4)。

表1 L-J法和960法EMB藥敏試驗結果與MIC值比較(株)

注a:3種檢測方法結果一致的比率

表2 960法和MIC法EMB藥敏試驗結果與L-J法結果比較

表3 L-J法和MIC法EMB藥敏試驗結果與960法結果比較

表4 L-J法和960法EMB藥敏試驗結果與MIC法結果比較

討 論

快速、準確的結核分枝桿菌藥敏試驗是耐藥結核病防控的首要條件。然而，傳統藥敏試驗各方法檢測結果的不一致性是各實驗室無法避免的問題。從國內外大量文獻報道中可知，檢測一線抗結核藥物中異煙肼和利福平藥敏試驗結果一致率不低于90%，而檢測EMB的結果一致率常處于較低水平[8-9, 12]。

本研究結果顯示：3種藥敏方法結果的一致率為75.4%。MIC值<4.0 μg/ml和>16.0 μg/ml的菌株中，3種方法一致率分別為94.7%(36/38)和100.0%(16/16)，均處于較高的水平，而MIC值4.0～16.0 μg/ml的72株菌中，僅43株藥敏試驗結果一致，一致率僅59.7%，提示結果不符合的情況主要發生于低濃度耐藥的菌株中。兩兩比較中L-J法和960法一致率77.0%，而L-J法、960法均與MIC法的一致率在85.0%以上，此結果低于蔡杏珊等[15]的報道，比Krüüner等[8]報道的符合率稍高。盡管地域性和菌株耐藥程度等差異存在，但國內相關報道通常樣本量較小，耐藥率較低，不足以說明EMB耐藥性的實際情況。國外大樣本量研究表明：EMB藥敏試驗結果不符的菌株，絕大部分顯示L-J法檢測為耐藥而960法敏感[8]，與本研究結果基本一致。本實驗中L-J法檢測為耐藥而960法和MIC法檢測為敏感的菌株有13株，占41.9%，同時，2株MIC值為1.0 μg/ml的菌株L-J法檢測為耐藥，提示L-J法檢測結果耐藥率偏高。此外，本研究中16株L-J法和MIC法檢測為耐藥而960法檢測為敏感(16/31，51.6%)，提示960法檢測耐藥率可能偏低。從MIC值梯度來看，不一致集中在4.0～16.0 μg/ml的藥物濃度范圍，其中14株MIC值16.0 μg/ml的菌株中，L-J法顯示均為耐藥，而960法檢測6株為敏感，亦提示960法檢測耐藥率偏低，但由于菌株數量限制，需要更大樣本量的研究來確認或解釋此現象。

分析導致結果不一致的原因，首先可能與細菌對EMB的異質性耐藥有關，即臨床分離株中可含有耐藥克隆和敏感克隆2種亞群，且研究認為，EMB耐藥與菌株的基因突變有密切關聯，而基因突變會降低菌株環境適應度[16]，導致耐藥株生長速率比敏感株要緩慢，羅氏培養基和液體培養基中耐藥株比敏感株要晚2～10 d生長[8]。該假說可解釋本研究中L-J法耐藥率偏高或960法(或MIC法)耐藥率偏低現象，即臨床分離株中耐藥克隆在L-J法中28 d后生長良好而報告陽性，而在960法和MIC法中(4～13 d)部分耐藥克隆尚未生長而報告陰性。再者，L-J法耐藥率偏高還可能與制備含藥羅氏培養基中的高溫加熱步驟有關，而960法和MIC法中藥物未經高溫加熱，且培養時間較短，不可控因素也相對減少，但此推測尚需進一步認證。此外，盡管960法與MIC法臨界濃度都推薦使用5.0 μg/ml，但MIC法中的臨界濃度5.0 μg/ml介于4.0～8.0 μg/ml中間，二者在MIC法讀結果時只有一孔之差，在變色與不變色的判讀中有人為因素及實驗誤差的存在[17]；事實上，MIC值在4.0～5.0 μg/ml之間應判定為敏感而5.0～8.0 μg/ml之間應判定為耐藥。本研究中MIC值處于臨界濃度范圍(4.0～8.0 μg/ml)的菌株中，3種方法一致率僅為60.3%(35/58)，差異性也在一定程度上取決于此。但從表2～3可以看出，MIC法無論與L-J法還是960法比較Kappa值都在0.7以上，證明該因素在藥敏試驗檢測結果的判定中影響甚微。

傳統L-J法現在仍是WHO推薦的藥敏檢測方法，其簡單、經濟等優勢明顯，但耗時較久，且其制作流程中加熱對于藥物效價的影響等環節無法避免成為了其方法上的缺陷，在很多情況下無法滿足臨床的需要；960法現已越來越多地應用于實驗室及醫院的藥敏檢測，該法4～13 d即可自動出檢測報告，敏感度和特異度較高，有利于患者的早期診斷和治療，但檢測成本較高是其無法應用于各基層實驗室的重要原因；MIC法也有國內外多篇文獻報道，該法雖對實驗室人員的技術水平要求較高，但其憑借簡便、敏感、快速、價廉(比L-J法略貴)等優勢，正越來越多地應用于臨床和科研的藥敏檢測。此外，探尋更適合臨床乙胺丁醇耐藥檢測的新方法是接下來工作亟待解決的重要問題[18]。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

Comparision on the detection effects of three methods forMycobacteriumtuberculosisethambutol sensitivity test

SUNQing*,ZHAOLi-li,CHENYan,ZHAOXiu-qin,WUYi-mou,WANKang-lin.

*PathogenicBiologyInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

WANKang-lin,Email：wankanglin@icdc.cn;WUYi-mou,Email：yimouwu@sina.com

Objective To compare the detection effects and the accordance of three drug sensitivity test (DST) methods based on bacterial culture for testingMycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis) sensitivity to ethambutol (EMB). Methods One hundred and twenty-sixM.tuberculosisclinical isolates sensitivity to EMB were detected with three methods, including L-J proportion method, Bactec MGIT 960 system (960 system) and microplate Alamar blue assay (MIC assay), and their results were compared interactively. The test data were analyzed using SPSS 17.0 software. TheKappavalue between 0.4-0.75 represents moderately consistency, andKappavalue ≥0.75 shows excellent concordance, whereasKappavalue less than 0.4 means poor consistency. Results The EMB sensitivity of 126 clinicalM.tuberculosisisolates was tested by the three methods, the total consistency was 75.4%(95/126). If L-J proportion method was used as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of 960 system and MIC assay were 62.8% (49/78), 100.0% (48/48), 77.0% (97/126) and 82.1% (64/78), 97.9% (47/48), 88.1% (111/126), respectively. MIC method showed a better consistency with L-J proportion method (Kappa=0.76), while 960 system represented a moderate concordance with L-J method (Kappa=0.56). If 960 system were taken as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of 960 system and MIC assay were 100.0% (49/49), 62.3% (48/77), 77.0% (97/126) and 98.0% (48/49), 77.9% (60/77), 85.7% (108/126), respectively. Both L-J proportion method and MIC assay showed high consistency with 960 system (Kappa≥0.70). If MIC assay was set as the standard control, the sensitivity, specificity and consistency of L-J proportion method and 960 system were 98.5% (64/65), 77.0% (47/61), 88.1% (111/126), and 73.8% (48/65),98.4% (60/61), 85.7% (108/126), respectively. The inconsistency among the three methods exis-ted in the MIC value of the drug concentration range 4.0 to 16.0 μg/ml. Conclusion There were better consistency among the three detecting methods for testingM.tuberculosissensitivity to EMB, but in which discrepancies existed on a certain extent. The results between 960 system and MIC assay were superb consistent. The MIC assay is more cost-effective, and more suitable for early diagnosis ofM.tuberculosisresistance to EMB.

Mycobacteriumtuberculosis； Ethambutol； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.008

國家自然科學基金(81201348)；“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003002-001)

421001 衡陽，南華大學病原生物學研究所[孫慶、吳移謀、萬康林(特聘教授)]；中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室 [孫慶(聯合培養研究生)、趙麗麗、陳燕、趙秀芹、萬康林]；杭州感染性疾病診治協同創新中心[趙麗麗、陳燕、趙秀芹、萬康林(均為特聘研究人員)]

萬康林， Email：wankanglin@icdc.cn；吳移謀， Email：yimouwu@sina.com

2014-11-27)