117株結核分枝桿菌臨床分離株對注射用抗結核藥物耐藥水平的研究

宋艷華 馬麗萍 陸宇 付育紅 高孟秋

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·論著·

117株結核分枝桿菌臨床分離株對注射用抗結核藥物耐藥水平的研究

宋艷華 馬麗萍 陸宇 付育紅 高孟秋

目的 對臨床Mtb菌株進行鏈霉素(Sm)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，了解其耐藥程度和交叉耐藥水平。方法 采用微孔板Alamar blue試驗(microplate Alamar Blue assay，MABA)，檢測117株Mtb臨床分離菌株的Sm、Km、Am和Cm的體外最低抑菌濃度(MIC)值。Sm、Km、Am、Cm的臨界濃度分別為2、4、1、2.5 μg/ml。將Sm、Km、Am 的MIC值大于臨界濃度≤16 μg/ml、32～64 μg/ml、>64 μg/ml分別為低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥；Cm的MIC值大于臨界濃度≤20 μg/ml、40～80 μg/ml、>80 μg/ml分別為低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥。結果 117株臨床分離株中，83株耐Sm，其中63株(75.9%)為高度耐藥，18株(21.7%)為低度耐藥，2株(2.4%)中度耐藥；23株耐Km和19株耐Am的耐藥株中分別有78.3%(18/23)和94.7%(18/19)高度耐藥，其余分別為兩藥的低度耐藥菌株，未發現中度耐Km或Am的菌株；14株Cm耐藥株的MIC值都在5～20 μg/ml，未發現高度耐藥株。83株Sm耐藥的菌株中有27.7%(23/83)和22.9%(19/83)分別對Km和Am耐藥，71.1%(59/83)對Am和Km均敏感。Km耐藥株和Am耐藥株中分別有78.3%(18/23)和94.7%(18/19)同時耐Km和Am(χ2=1.157，P>0.05)，且對Km和Am均高度耐藥；5株對Km低度耐藥，但對Am敏感。Am耐藥株和Cm耐藥株中，分別有68.4%(13/19)和92.9%(13/14)同時耐Am和Cm。結論 耐Sm或Km或Am的Mtb臨床分離株絕大多數為高度耐藥，耐Cm的Mtb臨床分離株以低度耐藥為主；絕大多數的Sm高度耐藥株仍對Am、Km敏感；高度耐Am或Km的菌株互為為完全交叉耐藥，Km低度耐藥的菌株對Am敏感；Am高度耐藥株多數對Cm為低度耐藥，絕大多數Cm耐藥株對Am高度耐藥。

結核分枝桿菌； 抗結核藥； 抗藥性, 細菌

結核病是由Mtb感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染性疾病，是伴隨人類歷史最長的疾病之一。注射用抗結核藥物Sm、Km、Am、Cm是一類重要的抗結核注射劑，作用機制相似，這組藥物之間存在交叉耐藥性[1-3]。了解目前流行臨床菌株對這類藥物的耐藥和交叉耐藥情況，對于選擇合理的抗結核藥物組成化療方案至關重要。微孔板Alamar blue試驗(microplate Alamar Blue assay，MABA)是一種顏色指示劑法，是近些年應用與檢測藥物最低抑菌濃度(MIC)值的一種重要方法，本實驗通過用MABA 法測定結核分枝桿菌對Sm、Km、Am、Cm的藥物敏感性，并分析Sm、Km、Am、Cm的交叉耐藥水平，以期望為臨床抗結核藥物的選擇提供科學的依據。

材料和方法

一、試驗菌株

117株臨床Mtb菌株來自北京胸科醫院參比室菌株庫2008年11月至2010年11月肺結核患者的菌株，菌株均經羅氏培養陽性且硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌種鑒定為Mtb；其中至少耐1種抗結核注射劑者89株，對上述4種藥物(Sm、Km、Am、Cm)均敏感者28株。來源患者中初治患者67例，復治50例；女34例，男83例，年齡(45.64±16.71) 歲。117例患者中35例曾經用過注射劑，其中初治1例，復治34例；應用Sm 6例，Sm+Km 1例，Sm+Am+Cm 6例，Km 1例，Am 10例，Am+CPm 6例，Cm 5例，注射劑的用藥時間在10 d 至24個月。H37Rv 標準株(ATCC27294)由北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室提供。

二、試驗藥物

Sm(美國Sigma公司，批號：638K0813)，Km(Sigma公司，批號：109K0147)，Am(Sigma公司，批號：048K1289)，Cm(Sigma公司，批號：018K10680)。

三、主要儀器及設備

恒溫培養箱(BINDER BD720，美國)；生物安全柜(ESCO LA2-6A1，新加坡)；壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠，HHS型)；電子天平(北京塞多利斯儀器系統有限公司，京利00000249)；超低溫冰箱(SANYO MDF-U4186F，日本)；低溫冰箱(青島海爾股份有限公司 BCD-2007ADZ)；渦旋震蕩器(Scientific industries G560E Vortex-2，美國)。

四、試驗方法

1.Mtb的培養及菌懸液的制備：將Mtb菌株從-80 ℃的冰箱中取出，融化后放置于7H11培養基上在37 ℃培養箱中培養，取3～4周處于對數生長期的亞培養物進行實驗，將菌落刮取并研磨均勻，配置成麥氏濃度為1的菌懸液[1×107菌落形成單位(CFU)/ml]。

2.MIC值的測定：將96孔微孔板除四周邊和第2列微孔外，其余各孔均加入100 μl 7H9液體培養基(不含吐溫)，向第2列微孔加入193.6 μl (Cm 孔為192.0 μl)7H9液體培養基，藥物的儲存液解凍后向第2列各孔加入6.4 μl濃度為2 mg/ml 的Sm、Km、Am，或8 μl濃度為2 mg/ml Cm，用移液器混合均勻并吸取100 μl加入第3列，依次稀釋到第10列，棄去自第10孔吸出的100 μl，分別得到Sm、Km、Am終濃度為：32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/ml；Cm 為: 40、 20、10、 5、 2.5、 1.25、0.625、0.3125、0.156、0 μg/ml的藥物濃度。第11列為空白對照。200 μl滅菌水加入96孔板的四周邊的各孔中。對于羅氏培養基比例法(L-J法)顯示耐藥的菌株或者L-J法敏感但MABA法檢測Sm、Km、Am的MIC>32 μg/ml(或Cm的MIC>40 μg/ml)的菌株，設定Sm、Km、Am的終濃度為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0 μg/ml；Cm 的終濃度為 160、80、40、20、10、 5、 2.5、 1.25、0.625、0 μg/ml。每批試驗以Mtb參考株(H37Rv敏感株)作為實驗的質量控制。將Mtb菌懸液(1×107CFU/ml)用7H9培養基(不含吐溫)進行20倍稀釋，取100 μl/孔接種于含100 μl抗菌藥的96孔微孔培養板中(菌液的終濃度約為2.5×105CFU/ml)，方法參照文獻[4-5]。置于37 ℃培養箱中培養。7 d 后生長對照孔和含藥孔加入20 μl Alamar blue和20% 吐溫-80 12.5 μl的混合液，37 ℃孵育24 h，記錄各孔的顏色，藍色孔為無生長，粉紅色孔為有生長，紫紅色孔再繼續37 ℃培養24 h，不變為粉紅色，其相連的藍色孔仍為藍色，則記錄為有生長。MIC定義為阻止顏色變化(從藍色變為粉紅色)的最低藥物濃度。每批試驗以H37Rv敏感株作為實驗的質量控制。

[6-7]設定Sm、Km、Am、Cm的臨界濃度分別為2、4、1、2.5 μg/ml。將Sm、Km、Am 的MIC值大于臨界濃度≤16 μg/ml、32～64 μg/ml、>64 μg/ml分別為低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥；Cm的MIC值大于臨界濃度≤20 μg/ml、40～80 μg/ml、>80 μg/ml分別為低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥。

五、統計學分析

對所記錄的研究菌株的MIC值進行統計分析，本研究采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析，使用χ2檢驗分析耐藥構成比，P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、Mtb臨床分離株對Sm、Km、Am、Cm的MIC值分布

117株臨床株中，Sm、Km、Am、Cm的MIC值分布見表1。耐Sm、Km、Am、Cm的菌株分別為83株(70.9%)、23株(19.7%)、19株(16.2%)、14株(12.0%)。

83株對Sm耐藥的菌株中，63株(75.9%)為高度耐藥，18株(21.7%)為低度耐藥，2株(2.4%)為中度耐藥；63株對Sm 高度耐藥的菌株中，44株(69.8%)對其他3種藥物均敏感，19株(30.2%)合并耐其他3種藥物中的至少1種藥物，兩者相比差異有統計學意義(χ2=19.841，P<0.001)。

表1 117株臨床分離株對Sm、Km、Am、Cm 的MIC值分布(株)

注 MIC 值0.5、1.0、2、4、16 μg/ml對應Cm的MIC值是0.625、1.25、2.5、5、20 μg/ml

二、Mtb臨床分離株對Sm與Am、Km、Cm交叉耐藥結果

83株耐Sm的菌株中，23株(27.7%)耐Km，19株(22.9%)耐Am，18株(21.7%)同時耐Km和Am(見表2)，三者比較差異無統計學意義(χ2=0.922，P>0.05)；Sm耐藥株中，59株(71.1%)對Am和Km均敏感。

63株Sm的MIC>64 μg/ml的高度耐藥株中，20.6%(13/63)合并Am和Km高度耐藥(MIC>128 μg/ml)；69.8%(44/63)對Km和Am均敏感(兩藥的MIC均≤1 μg/ml)，同時耐Km和Am的菌株(13株)所占比率低于對Km、Am均敏感的菌株(44株)所占的比率(χ2=30.787，P<0.001)。2株 Sm的MIC值在32～64 μg/m的菌株，均對Km、Am高度耐藥(MIC>128 μg/ml)。18株Sm的MIC在4～16 μg/ml的菌株中，3株(16.7%)對Km、Am均高度耐藥(MIC>128 μg/ml)，15株(83.3%)對Km、Am敏感(1株對Km、Am的MIC值分別為4 μg/ml和0.5 μg/ml；其余14株Km 的MIC值均≤2 μg/ml，Am的 MIC值均≤0.5 μg/ml)。

表2 117株臨床分離株對Sm與Am、Km交叉耐藥的檢測結果

18株Km和Am 的MIC均>128 μg/ml耐藥的菌株中，15株(83.3%)Sm的 MIC值≥32 μg/ml，2株(11.1%) Sm的 MIC是8 μg/ml，1株(5.6%)MIC是4 μg/ml (表2)；Sm高中度耐藥株所占比率高于其低度耐藥株(χ2=16.000，P<0.001)，沒有發現對Km和Am均高度耐藥但對Sm敏感(MIC≤2 μg/ml)的菌株。

23株Km耐藥株和19株Am耐藥株中，18株對Km和Am均耐藥，且都是高度耐藥(MIC>128 μg/ml)，分別占Km耐藥株和Am耐藥株的78.3%(18/23)和94.7%(18/19)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=1.157，P>0.05)。而Km低度耐藥株共5株，這5株均對Am敏感(MIC≤1 μg/ml)，Am低度耐藥株1株(MIC為4 μg/ml)，其Km的MIC是4 μg/ml。94株Km敏感的菌株中，有93株對Am敏感，這些菌株中Km的MIC均值[(1.0672±0.60919)μg/ml]高于Am的MIC均值[(0.4005±0.19114)μg/ml]。

19株Am耐藥株和14株Cm耐藥株中，有13株菌同時對Am和Cm耐藥(表3)，分別占 68.4%(13/19)和92.9%(13/14)(P>0.05，Fisher確切概率)；并且這13株菌株均對Am高度耐藥，占Am高度耐藥株的72.2%(13/18)，98株Am敏感株中只有1株耐Cm。

表3 117株臨床菌株對Am與Cm的交叉耐藥表

討 論

一、MABA 法測定Mtb的Sm、Km、Am、Cm臨界濃度的界定

基于Alamar blue測定Mtb對藥物敏感性的MABA法是種較為經濟、快速、準確的顏色指示劑藥敏法。這種方法與傳統比例法及其他液體培養基藥敏法有很好的一致性[4,6,8-9]。使用96孔板相對于試管可以減少加入藥品及菌液的用量，而且時間較短，僅用8 d就能得出結果，比傳統方法縮短近3周時間。這種方法更能直接、快速地檢測菌株對藥物的應答情況，有助于指導臨床早期選擇合理的藥物制定合適的化療方案。藥物敏感性判定的關鍵在于耐藥的臨界濃度，本研究根據WHO推薦的液體培養法Bactec 460和MGIT 960法抗Mtb注射劑的臨界濃度[6-7]，Sm、Km、Am、Cm臨界濃度參考值分別為2.0、4.0、1.0、2.5 μg/ml。

二、Mtb臨床分離株對4種抗結核注射劑的MIC值分布

本研究中，Sm的MIC值分布顯示對Sm耐藥株中75.9%(63/83)菌株為高度耐藥株(MIC≥128 μg/ml)，這一比例明顯高于對Sm的中低度耐藥株(MIC=4～64 μg/ml)所占比例之和，而且發現Sm的MIC值以中度耐藥(MIC=32～64 μg/ml)的菌株最少，本研究只發現2例。Sugawara等[10]測定74株來自中國的耐Sm的Mtb菌株，顯示45株(61%)是MIC>100 μg/ml的高度耐藥，與本研究結果接近。但是巴塞羅納地區一項研究的菌株則以中低度耐藥為主[11]。Km和Am耐藥菌株的MIC值分布顯示，78.3%和94.7%為高度耐藥，Cm的耐藥株MIC值都在5～20 μg/ml，沒有高度耐藥菌株，耐藥株對Cm的MIC值略低于美國和非洲的報道[1,12]，這可能與菌株來源不同及不同的藥敏試驗方法的差異相關。但總的來說臨床分離株耐Cm的比例較低，且是以低度耐藥為主。

三、Mtb臨床分離株對4種抗結核注射劑的交叉耐藥分析

Sm和Am、Km分子結構和抗菌機制相似，均作用于細菌的核糖體，阻礙蛋白的合成，這類藥物之間存在交叉耐藥性。我國Mtb對氨基苷類藥物耐藥及交叉耐藥情況缺乏大規模的調查，最新全國結核病耐藥性基線調查報告顯示[13]，我國的涂陽肺結核患者對抗結核藥物的總耐藥率為39.12%，其中一線抗結核藥物耐藥率最高的是Sm (28.93%，初治27.69% 復治37.20%)，而對Km的耐藥率為2.34%。結合近些年其他小范圍的注射劑耐藥率的調查，顯示Sm的耐藥率明顯高于其他3種藥物[2,14-15]，對Sm耐藥的菌株仍可有70%以上對其他3種藥物敏感，但是耐Km(Am)或Cm的菌株90%左右對Sm耐藥[2, 15]， Km與Am的耐藥率相近。Am(Km)與Cm的耐藥率不同報道間有差異，上海報道Am與Cm的耐藥率相近，分別為22.1%和19.5%[2]；而江蘇報道為8.2%和3.3%[16]，但是較為一致的是對Cm耐藥的菌株絕大多數也對Am耐藥。

本研究中采用的菌株多數為羅氏藥敏試驗結果為至少耐4種抗結核注射劑中的一種藥的菌株，Sm、Km、Am、Cm的耐藥率分別為70.9%、19.7%、16.2%、12.0%。Sm耐藥率明顯高于其他3種藥物，而Am、Km、Cm的耐藥率比較差異沒有統計學意義。即使對Sm高度耐藥的菌株中也有69.8%對Km、Am、Cm均敏感，所以多數對Sm高度耐藥的菌株仍然可以選用其他3種藥物治療。本研究中對Km、Am、Cm同時耐藥的菌株均耐Sm，且絕大多數是高度耐Sm，但小部分菌株對Sm的MIC在4～16 μg/ml，應用Sm可能有效。有報道少數對Km、Am高度耐藥菌株對Sm敏感[17-18]，但是本研究中沒有發現這種菌株。注射劑的現狀考慮與抗結核用藥歷史有關，早期Sm應用后選擇出對Sm耐藥菌株的基礎上，隨著Km、Am的應用進一步選擇出了聯合耐藥突變株。目前，尚未發現關于Sm耐藥株中產生耐Am或Km突變株頻率是否增加的研究報道。所以，一般情況下考慮對Km、Am、Cm耐藥的患者不再考慮采用Sm治療，但是在有可靠的藥敏試驗結果、而且需要注射劑組成方案時也不能完全放棄Sm。

Km、Am和Cm是目前MDR-TB治療中的核心抗結核藥物，這3種藥物的交叉耐藥情況是我們關注的重點。本研究顯示，對Am或Km耐藥的菌株中絕大多數是對兩藥同時高度耐藥的菌株，即Am和Km高比例交叉耐藥；而且對于高度耐藥的菌株，兩藥是完全交叉耐藥，但仍有一小部分對Km低度耐藥的菌株對Am敏感，這與Maus等[1]和Engstr?m等[19]的體外試驗結果及臨床株藥敏試驗結果相一致。另外，體外試驗可以篩選出對Km高度耐藥、對Cm低度耐藥的Mtb突變株[19]；本研究在臨床株中也發現了類似的交叉耐藥表型，即多數對Am高度耐藥菌株對Cm呈現中低度耐藥，但是也發現部分對Am高度耐藥菌株(27.8%)對Cm仍然敏感。體外研究顯示，Cm從敏感株中篩選出的耐藥株對Km呈現低度耐藥，對Am敏感[1,19]。所以，目前專家建議Km、Am和Cm三藥的選用順序是Cm→Km→Am，這樣前藥耐藥出現后后藥仍可能有效。但是從本研究及其他研究的結果來看[1,19-20]，Mtb臨床分離株中，對Km和Am的耐藥率相當，幾乎完全交叉耐藥；所以，在沒有藥敏試驗條件下如果對Km和Am中的一種藥物治療無效，則不主張應用另一種藥物。另外，本研究表明對Km和(或)Am高度耐藥菌株絕大多數對Cm呈現低度耐藥或者敏感；國內其他研究也顯示對Km和(或)Am的耐藥率高于Cm，對于Km和(或)Am耐藥的菌株卻部分對Cm敏感[20]。所以，筆者考慮對Km和Am耐藥的菌株仍有部分可以選用Cm進行抗結核治療，這尤其在XDR-TB治療中有重要意義。

本研究數據顯示，臨床分離株中耐Sm和(或)Km和(或)Am的Mtb菌株均以高度耐藥為主，耐Cm的臨床分離株以低度耐藥為主，對Sm高度耐藥的絕大多數菌株仍可以選用 Am、Km、Cm治療；對Km和(或)Am的高度耐藥菌株呈現完全交叉耐藥，對Km低度耐藥的菌株對Am敏感。Cm仍是目前對Km和(或)Am耐藥菌株可以選用的抗結核藥物。

參 考 文 獻

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(本文編輯：薛愛華)

Study on the levels of injectable antituberculosis drug resistance in 117Mycobacteriumtuberculosisclinical strains

SONGYan-hua，MALi-ping，LUYu，FUYu-hong，GAOMeng-qiu.

DepartmentofTuberculosis,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingTuberculosisandThoracicTumourResearchInstitute,Beijing101149,China

GAOMeng-qiu，Email：gaomqwdm@aliyun.com

Objective To observe the levels of the resistance and cross-resistance to streptomycin (Sm), kanamycin (Km), amikacin (Am), capreomycin (Cm) inMycobacteriumtuberculosis(Mtb) clinical strains by drug susceptibility test (DST). Methods The MICs of Sm, Km, Am, and Cm in 117 Mtb clinical strains were detected by microplate Alamar blue assay (MABA). The critical concentration of Sm, Km, Am, and Cm on Mtb were 2, 4, 1 and 2.5 μg/ml, respectively. When the MICs of Sm/Km/Am on Mtb were greater than critical concentration and ≤16 μg/ml, or 32-64 μg/ml, or >64 μg/ml, the drug resistances were defined as low level, moderate level, and high level, respectively. But that for Cm on Mtb was greater than critical concentration and ≤20 μg/ml, or 40-80 μg/ml, or >80 μg/ml. Results Of 117 Mtb clinical isolates, 83 were Sm-resistant, in which 63 isolates(75.9%)were high resitance, 18 isolates (21.7%) were low resistance, 2 isolates (2.4%) were moderate resis-tance. 78.3% of 23 Km-resistant strains and 94.7% of 19 Am-resistant strains were high-level resistance (MIC≥128 μg/ml), other isolates were low-level resistant to Am/Km, no moderate-level resistant isolates were observed. The MICs of 14 Cm-resistant isolates were 5-20 μg/ml, and there were not high level of Cm-resistant isolates. Of 83 Sm-resistant isolates, 27.7% (23/83) and 22.9% (19/83) were resistant to Km and Am respectively, 71.1% (59/83) were sensitive to both Km and Am. 78.3% (18/23) of Km-resistant isolates and 94.7% (18/19) of Am-resistant isolates were highly resistant to both Km and Am, which had no significant difference (χ2=1.157,P>0.05). Five strains were low resistance to Km, but sensitive to Am. 68.4%(13/19) of Am-resistant isolates and 92.9% (13/14) of Cm-resistant isolates were resistant to both Am and Cm. Conclusion The majority of the Sm/Km/Am-resistant clinical isolates were high resistance, and the majority of the Cm-resistant clinical isolates were low resistance. Most of highly Sm-resistant isolates were susceptible to Km/Am. The highly Am/Km-resis-tant isolates showed cross resistance each other. A small proportion of lowly Km-resistant isolates were sensitive to Am. Most of highly Am-resistant isolates were low resistance to Cm. Almost all of Cm-resistant isolates were high resistant to Am.

Mycobacteriumtuberculosis； Antitubercular agents； Drug resistance, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.009

北京市醫院管理局臨床醫學發展專項(ZYLX201304)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 北京市結核病胸部腫瘤研究所結核科(宋艷華、馬麗萍、高孟秋)，藥物研究室(陸宇)，國家結核病臨床實驗室(付育紅)

高孟秋，Email：gaomqwdm@aliyun.com

2014-07-14)