采用反義寡核苷酸聚乳酸可降解微球建立小鼠腎陽虛模型

李曉清，應堅（重慶市中醫院腫瘤科，重慶 404100）

腎陽虛證在中醫基礎理論研究和臨床應用中均有重要地位，其模型研究一直是腎陽虛證研究的關鍵，已有的腎陽虛證模型先后采用了衰老大鼠、外源性藥物、手術切除性腺等方法[1-4]。上述動物模型對該證型的實驗研究產生了重要的促進作用。但隨著研究的深入，這些模型某些方面尚不能完全滿足實驗要求:（1）大鼠的遺傳背景復雜，可能會對機體的發病及治療反應產生影響。（2）腎上腺軸的變化和證型之間的因果關系不能完全確定。長期生命活動中各種應激以及腎虛都可能造成HPA軸功能下降。（3）外源性糖皮質激素腎陽虛證模型中外源性糖皮質激素與腎陽虛證之間因果關系不直接。糖皮質激素不僅可與糖皮質激素受體（GR）結合，而且可與鹽皮質激素受體（甚至其他受體）結合，進而導致機體產生復雜變化[5-8]。

反義寡核苷酸（AS-ODN）可選擇性抑制目的基因的表達，但天然AS-ODN的半衰期一般只有15～20min，筆者將AS-ODN經硫代磷酸化修飾后，用可降解聚乳酸微球包埋，以達到持續、穩定地抑制GR表達的效果。本實驗擬通過小鼠皮下注射AS-ODN聚乳酸可降解微球抑制GR表達以建立腎陽虛模型。

1 材料

1.1 儀器

55P27型超速冷凍離心機（日本Hitachi公司）；高效液相色譜儀，包括紫外檢測器（美國Agilent公司）；DigBeh-LM16型小鼠自主活動計算機視頻分析系統（上海吉量軟件科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

聚乳酸-羥基乙酸共聚物75/25（PLGA75/25，成都一平醫藥有限公司，黏度:0.2 dl/g，分子質量:15000）；Trizol?抽提試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄（RT）試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒和DL2000標志物（Marker）（日本TaKaRa公司）；AS-ODN（委托北京賽百盛基因技術有限公司合成，批號:2728142，純度:99.9%）。

1.3 動物

3周齡C57小鼠30只，♂，體質量5～7 g，第三軍醫大學大坪醫院野戰科外研究所實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK（渝）2008-0003。本研究通過我院醫學倫理會論證。

2 方法與結果

2.1 AS-ODN聚乳酸可降解微球的制備

根據Gene bank小鼠基因序列（序列號為X04435）設計，AS-ODN的序列為5′-TAAAAACAGGCTTCTGATCCT-3′，對所有堿基采用硫代磷酸化修飾（由北京賽百盛基因科技有限公司代為合成）。首先在5ml二氯甲烷中加入50mg丙交酯和己交酯1∶1的共聚物，以及AS-ODN（已硫代磷酸化）的水溶液[5mg AS-ODN+100μl聚乙烯醇（0.4%，m/V）]，以4000 r/min攪拌5min，然后加入160ml水性分散介質（0.9%無菌生理鹽水），以6000 r/min攪拌5min，通過溶劑蒸發形成中心球（直徑在5～15 μm）；以離心半徑6.3 cm、6000～8000 r/min離心10min，水洗3次，冷凍干燥48 h收集，在雙蒸水中洗滌去除未被包裹的AS-ODN，最后冷凍干燥，得可降解微球。采用高效液相色譜法[9-10]測定其載藥量為9～11.5μg/mg。

2.2 分組與給藥

小鼠隨機分為A、B、C、D、E組，每組6只，以組為單位將小鼠飼養在12h明亮/12h黑暗、恒溫21℃、濕度為55%的清潔級環境中，自由攝食和飲水。A組小鼠皮下注射0.2ml生理鹽水，B～E組依次皮下注射AS-ODN聚乳酸可降解微球0.1、0.2、0.4、0.8mg（0.2ml生理鹽水溶解），每周給藥1次，連續給藥4周。

2.3 指標觀察

2.3.1 一般情況 給藥后每日觀察各組小鼠的眼神（眼球運動）、呼吸、睡眠、皮毛光滑程度等，記錄給藥后每周小鼠的體質量，以了解小鼠發育情況。

2.3.2 活動度 給藥4周后，采用多功能小鼠自主活動記錄儀進行自主活動度檢測，即將小鼠放置于測量筒內靜置5min，然后連續記錄15min內小鼠的活動度，計算每1min平均活動度，以“次/min”為單位。

2.3.3 臟器中GR mRNA表達 給藥4周后取各組小鼠，斷頸處死，收集肝臟、腎上腺、腦等標本，按照Trizol?抽提試劑說明書方法提取肝臟、腎上腺、腦組織的RNA。取樣本RNA溶液1μl加入99μl超純水，測定260nm、280nm波長處光密度（OD），計算OD260/280比值。若OD260/280比值介于1.8～2.0，表示樣本RNA溶液純度高。按照RT試劑盒產品說明書方法將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為:30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min。反應完畢后在－20℃保存。按照PCR試劑盒說明進行目的片段擴增，擴增條件為:94℃預變性5min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，35個循環；最后72 ℃延伸5min。PCR引物序列:GR上游引物為5′-AGTTCTCCTCCGTCCAGCTC-3′，下游引物為5′-AACACCTCAGGCTCGATCAC-3′，目的產物大小為414 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）序列:上游引物為 5′-ACCACAGTCCATGCCATCA-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產物大小為450 bp。以120 V電壓在加有核酸染料Gold view的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳15min，經凝膠紫外掃描成像儀觀察，凝膠成像掃描儀分析，記錄積分光密度（IOD）。以GR目的條帶IOD值與GAPDH條帶IOD的比值表示GR mRNA表達情況。

2.4 統計學方法

以SPSS 13.0統計分析軟件進行統計學處理。所有數據用表示，各組數據采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況

與A組比較，其余組小鼠給藥后在第4周開始逐漸出現體毛稀疏無光澤、拱背、少動、扎堆、豎毛、反應遲鈍等腎陽虛表現；其體質量逐漸減輕，其中B組小鼠從給藥后3周開始減輕，C、D組小鼠從給藥后1周開始減輕，E組小鼠從給藥后2周開始減輕，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組小鼠不同時期的體質量見表1。

表1 各組小鼠不同時期的體質量（，n＝6，g）Tab 1 Weights of mice in all groups at different stages（，n＝6，g）

表1 各組小鼠不同時期的體質量（，n＝6，g）Tab 1 Weights of mice in all groups at different stages（，n＝6，g）

注:與A組比較，＊P＜0.05Note:vs.groupA，＊P＜0.05

組別A組B組C組D組E組7周齡21.50±1.8719.00±1.79＊15.17±2.22＊17.67±2.73＊15.33±1.21＊3周齡6.00±1.795.83±1.766.00±1.416.50±1.876.33±1.634周齡12.12±2.0411.27±1.649.17±6.33＊10.83±1.17＊10.11±1.415周齡18.17±1.7216.33±3.2713.50±1.05＊14.33±2.07＊12.67±1.37＊6周齡20.83±1.4718.50±1.97＊14.67±1.97＊16.33±2.16＊14.83±1.72＊

3.2 小鼠活動度變化

A、B、C、D、E組小鼠給藥4周后的活動度分別為（2.82±0.75）、（1.42±0.25）、（1.25±0.31）、（1.35±0.21）、（1.51±0.13）次/min。與A組比較，其余組小鼠的活動度降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3.3 小鼠臟器中GR mRNA表達情況

與A組比較，其余組小鼠肝、腎上腺、腦組織中GR mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。各組小鼠肝臟、腎上腺、腦組織中GR mRNA表達的電泳圖見圖1，表達水平測定結果見表2。

圖1 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達的電泳圖注:M表示Marker；1～5依次為A～E組的GAPDH產物；6～10依次為A～E組的GR mRNA產物Fig 1 Electrophoretograms of GR mRNA expression in liver，adrenal gland and brain of mice in all groupsNote:M refers to Marker；1-5 respectively represent the GAPDH products of groups A-E；6-10 respectively represent the GR mRNA products of groupsA-E

表2 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達水平的測定結果（，n＝6）Fig 2 GR mRNA expressions in liver，adrenal gland and brain of mice in all groups（，n＝6）

表2 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達水平的測定結果（，n＝6）Fig 2 GR mRNA expressions in liver，adrenal gland and brain of mice in all groups（，n＝6）

注:與A組比較，＊P＜0.05Note:vs.groupA，＊P＜0.05

組織肝臟腎上腺腦E組0.68±0.10＊0.57±0.08＊0.56±0.09＊A組0.85±0.100.88±0.030.94±0.06 B組0.54±0.04＊0.68±0.05＊0.54±0.04＊C組0.58±0.02＊0.50±0.09＊0.58±0.06＊D組0.63±0.04＊0.52±0.05＊0.70±0.06＊

4 討論

腎陽虛證模型的建立是腎陽虛證試驗研究的基礎。腎陽虛患者GR表達降低，溫補腎陽能夠提高GR表達水平[6，11]。由此提出假設:抑制GR的表達可以作為建立腎陽虛模型的方法。前期研究發現，淫羊藿苷能提高腎陽虛細胞GR表達水平，并呈現出劑量依賴性[8]，在細胞水平通過抑制GR表達建立了腎陽虛證模型。本實驗擬在動物水平通過抑制GR表達建立小鼠腎陽虛證模型，希望在一定程度上再次驗證假設。采用遺傳背景單一的C57小鼠復制模型可以有效地降低遺傳背景復雜性對實驗本身的干擾。復制模型過程中僅抑制GR表達，影響條件單一，GR表達抑制與動物出現的癥狀之間的因果關系清楚，也使HPA軸和癥候之間的關系更加明確。從小鼠幼年開始抑制GR表達使筆者首次觀察到GR表達抑制對小鼠生長發育的影響，這也符合“腎主生長發育”的理念。在研究中除A組外，各組小鼠均出現了拱背、少動、扎堆、豎毛、體質量增長緩慢、發育遲緩等腎陽虛證的外在表現。由實驗結果可見，與A組相比，其余各組小鼠體質量都表現出下降趨勢，此為抑制GR而影響小鼠生長發育的表現。

目前主要通過腔室、給藥泵等方式注射AS-ODN，能夠達到較好的局部基因表達抑制效果，使基因mRNA表達水平下降20%～56%[12-13]，但全身基因表達抑制未見報道。本實驗采用皮下注射的方式以達到全身GR抑制的目的，對肝、腎上腺、腦組織進行GR表達的測定結果均顯示GR表達下調。

Islam A等[10]采用AS-ODN聚乳酸可降解微球400μg對Wistar大鼠顱內注射，成功使目的基因mRNA表達下調了39%、目的蛋白下降了80%。目前AS-ODN皮下注射抑制GR表達的有效劑量未見報道。本文參考文獻[10]，設立0.1、0.2、0.4、0.8mg 4個劑量組。從實驗結果可見，各個劑量AS-ODN聚乳酸可降解微球均可抑制GR基因的表達，GR抑制效果與劑量不完全呈劑量依賴關系，其中原因有待進一步研究。另外，各個劑量AS-ODN聚乳酸可降解微球均使小鼠表現出發育遲緩、活動度降低等腎陽虛表現。

本實驗通過AS-ODN聚乳酸可降解微球皮下注射使小鼠呈現出腎陽虛癥狀，而且與GR基因表達抑制相關。這是對腎陽虛動物模型建立的初步探討，在后續實驗中還需要進一步驗證。

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