鹽堿脅迫下玄參幼苗的抗性生理響應研究Δ

付英杰，曲曉歡，李艷芝，王建安（濟寧醫學院藥學院，山東日照276826）

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的塊根，主要成分為環烯醚萜苷類、揮發油、甾醇、多糖等成分，具有清熱涼血、瀉火解毒等功效，為傳統“浙八味”中藥之一[1]。玄參喜溫暖濕潤氣候，耐寒，對土壤品質要求較低，通常選擇肥沃、排水良好的砂質壤土及富含腐殖質的土壤栽培；原產于浙江筧橋，現多為栽培品，主產于浙江、山東、陜西[2]。筆者在黃河三角洲考察時發現，玄參能夠在鹽堿地中生存，因此考慮玄參有可能成為鹽堿地新栽培藥用品種。目前我國擁有6.7×106hm2的次生鹽堿地，并且還存在約有1.7×107hm2的潛在鹽堿土[3]，其開發利用受到高度重視。目前治理鹽堿地較有優勢的方法是種植耐鹽植物，可抑制土壤返鹽，增加土壤有機質以改善土壤結構。而種植耐鹽植物首先要考察植物耐鹽生理，其次對植物耐鹽能力的提高進行研究[4]，從而確定該植物的耐鹽堿特性，并能夠初步探究其耐鹽堿機制。

目前玄參栽培方面的研究多集中在肥料種類、施肥技術、管理技術、栽培類型及遺傳性等[5-6]，而尚未見在鹽堿化土壤中種植玄參的研究性文獻。因此，筆者擬通過對鹽堿脅迫下玄參幼苗的生長指標及抗性生理響應機制進行系統研究，以探討抗氧化防御和滲透調節機制在玄參幼苗對鹽堿脅迫適應中的作用。

1 材料

1.1 儀器

UV-2450型紫外分光光度計（日本島津公司）；LD4-2A型低速離心機（北京醫用離心機廠）；HWSY11-K2C型恒溫水浴鍋（北京長風儀器儀表公司）；DL-PNT3000土壤鹽堿度（活度）檢測儀（德國STEPS公司）；DDL-9604型電導率儀（北京格樂普高新技術有限公司）。

1.2 幼苗與試劑

玄參幼苗產自浙江省磐安縣；硫酸鈦（CP，批號：20131213，純度：98%）、核黃素（批號：F20080123，純度：98%）均購自國藥集團化學試劑有限公司；脯氨酸（Pro，中國食品藥品檢定研究院，批號：140677-201308，純度：98%）；2-硫代巴比妥酸（批號：T108505，純度：98%）、甲硫氨酸（批號：M104886，純度：99%）、愈創木酚（批號：G112735，純度：99%）均購自上海晶純生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白、各指標測定試劑盒均購自上海生工生物工程有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 幼苗的栽培

取玄參幼苗110株，栽培于塑料花盆（上口徑30 cm，高25 cm，具底盤）中。基礎土壤選取砂質土（土壤養分測定為有機質14 g/kg、全氮0.95 g/kg、有效磷17 mg/kg、速效鉀135 mg/kg，土壤肥力為中等稍低）。緩苗期澆水、正常管理，每隔4 d澆灌100 ml含大量元素的Hoagland營養液[7]。葉片長至5片時，選取10株長勢相同的為一組，分別以NaCl、NaHCO3和蒸餾水澆灌（見表1）。每隔4 d澆灌1次，并采用土壤鹽堿度檢測儀及pH計測定土壤平均鹽堿度，使其維持在表1含鹽量（變動幅度±10%）、pH（變動幅度±0.1）條件，同時測定相同濃度下儲備土壤的堿化度。幼苗置于光照培養箱中，控制溫度（20±2）℃，光暗周期13 h/11 h，光照強度2000 lx，培養時間16 d（表中J1～J5、Y1～Y5為堿、鹽不同濃度，CK為空白對照，簡稱對照）。

2.2 指標的測定

測定玄參幼苗生長指標（株高、干質量、鮮質量）。參考文獻[8-17]測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性與葉綠素（Chl）、過氧化氫（H2O2）、Pro、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、丙二醛（MDA）含量，以及膜透性（RMP）。

表1 鹽堿脅迫條件及分組Tab 1 Conditions of saline-alkali stress and grouping

2.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件處理試驗數據。各組數據均為計量資料，棄去最小、最大值后數據以±s表示，采用LSD檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組玄參幼苗生長指標測定結果

本研究顯示，隨鹽堿濃度升高，玄參幼苗株高逐漸降低。當堿脅迫超過150 mmol/L后，株高出現較大幅度降低；當鹽脅迫超過50 mmol/L后，株高開始降低。在堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過50 mmol/L后，玄參幼苗鮮質量明顯降低；在堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過100 mmol/L后，玄參幼苗干質量明顯降低。結果表明，玄參幼苗具有一定的耐鹽堿性，但兩者抗性有區別，其耐堿性強于耐鹽性。各組玄參幼苗生長指標測定結果見圖1。

圖1 各組玄參幼苗生長指標測定結果Fig 1 Determination results of growth indexes of S.ning poensis seedlings in all groups

3.2 各組玄參幼苗Chl含量測定結果

非鹽生植物受鹽脅迫后，其光合作用直接受到抑制，Chl解體，且合成受抑制，最終不能通過光合作用來獲取植物生長所用的能量而導致生長受抑制；而鹽生植物則不同，一定濃度的鹽反而可以促進光合作用，但當鹽濃度超過閾值后也會發生抑制[18]。本研究顯示，當堿脅迫超過150 mmol/L、鹽脅迫超過50 mmol/L時，玄參幼苗Chl含量減少，葉片顏色黃化。該結果印證了生長指標測定的結論，同時推斷玄參幼苗在低濃度鹽堿脅迫下光合作用反而可能被促進。各組玄參幼苗Chl含量測定結果見圖2。

圖2 各組玄參幼苗Chl含量測定結果Fig 2 Determination results of Chl contents of S.ningpoen sis seedlings in all groups

3.3 各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標測定結果

本研究顯示，當鹽脅迫為50 mmol/L、堿脅迫為150 mmol/L時，玄參幼苗SOD、POD活性最強；當鹽脅迫為150 mmol/L、堿脅迫為50 mmol/L時，CAT活性最強；隨鹽堿濃度升高，H2O2、MDA含量逐漸增加；隨鹽堿濃度增加，RMP水平升高，即膜穩定性逐漸降低。結果表明，鹽堿脅迫均造成了細胞質膜的損傷，鹽堿能刺激植物迅速產生抗氧化保護酶對抗活性氧。CAT、POD、SOD依次為低、中、高濃度堿脅迫的主要保護酶，POD、SOD、CAT依次為低、低、中濃度鹽脅迫的主要保護酶，且鹽脅迫中的H2O2、MDA含量及細胞質膜受損程度明顯高于堿脅迫，因此可以認為玄參幼苗的耐堿性較耐鹽性強，這也與Chl測定結果相吻合。值得指出的是，盡管在150 mmol/L鹽濃度時CAT活性較高，植株卻普遍出現萎蔫、黃化、倒伏等現象。綜合考慮，玄參幼苗耐堿性仍強于耐鹽性。各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標測定結果見圖3。

3.4 各組玄參幼苗滲透調節生理指標測定結果

植物在逆境中，Pro作為蛋白分解產物，具有滲透調節、穩定大分子、降低氨毒性、作為能量庫等多重作用；SS具有滲透調節、作為碳架及能量庫的多重作用，可穩定細胞膜及原生質，一般情況下，隨SS累積，植物抗逆性逐漸增加。本研究顯示，當鹽堿濃度大于100 mmol/L時，Pro含量停止累積，但堿濃度下Pro含量明顯高于鹽濃度下；隨鹽堿濃度升高，SP含量逐漸減少；當鹽濃度大于100 mmol/L、堿濃度大于150 mmol/L時，SS量停止積累，但兩脅迫組玄參幼苗SS含量及趨勢差別不大，推測玄參幼苗耐堿性強的原因之一是Pro的大量積累起到了緩沖的作用。各組玄參幼苗滲透調節生理指標測定結果見圖4。

4 討論

在鹽堿條件下，植物一般可通過滲透調節、抗氧化能力的提升、營養元素平衡、改變代謝類型、維護膜的完整性等方法來減輕傷害，其中前2種方法存在于大多數耐鹽堿植物中：（1）滲透調節，如可溶性糖、脯氨酸、甜菜堿、無機離子、逆境蛋白等物質濃度的改變。其中脯氨酸可形成類似親水膠體的聚合物，以維持滲透平衡，并保持細胞膜的穩定性；而可溶性糖則能在細胞中積累以維持細胞膨壓；逆境蛋白如胚胎發育晚期豐富蛋白（LEA蛋白）的產生是水分脅迫的一種保護反應；（2）抗氧化物質及抗氧化酶的產生。由于鹽堿脅迫時植物體產生的大量活性氧極易造成組織氧化損傷，因此植物自身能夠產生清除活性氧的酶和抗氧化物。抗氧化酶主要包括CAT、POD、SOD、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽過氧化物酶（GP）等[19]。同時，鹽堿脅迫會引起植物的水分紊亂、生長限制、氣孔關閉、CO2固化率降低等[20]。這些植物生長的促進或抑制，與光合作用直接相關，如對光能吸收與轉化的影響和對光合電子傳遞、碳同化的影響，因此，葉綠素含量變化也間接反映了植物的抗逆性。

圖3 各組玄參幼苗酶促抗氧化體系生理指標測定結果Fig 3 Determination results of physiological indexes of enzymatic antioxidative systems of S.ningpoensis seedlings in all groups

圖4 各組玄參幼苗滲透調節生理指標測定結果Fig 4 Determination results of physiological indexes of osmotic regulation of S.ningpoensis seedlings in all groups

本研究結果表明，鹽、堿脅迫對玄參幼苗的生長有不同程度的影響，一定濃度范圍中其幼苗的株高、干質量及鮮質量均有不同程度的下降，并伴隨著細胞質膜透性的降低以及MDA、H2O2的產生，其結果證明了一定濃度的鹽、堿對玄參幼苗的細胞具有毒害作用。在此環境下，玄參幼苗通過改變SOD、CAT、POD等保護酶活性而清除活性氧，以及增加Pro及SS等滲透調節劑的途徑來保持抗滲透脅迫能力，從而減少傷害。值得提出的是，一般鹽堿脅迫情況下，植物光合作用通常下降，但本文發現玄參幼苗在一定濃度的堿脅迫下反而出現了光合作用增強的現象，可能與堿抗性有一定關系，有待深入研究。

通過研究，筆者還發現玄參幼苗對鹽、堿的脅迫具有不同程度的耐性：可耐受相當于150 mmol/L NaHCO3濃度（pH≈8.3）的堿化土壤或50 mmol/L NaCl濃度（含鹽量≈0.35%）的鹽化土壤。因此在今后的推廣種植中，可以適當考慮選擇中堿度或低鹽度的土壤。這為今后其他中藥的種植及開發適合鹽堿地種植的中藥品種提供了相應的理論依據。

本研究旨在考察玄參對鹽堿的抗性，為耐鹽堿玄參品種選育研究提供參考，因此選用幼苗作為研究對象。而成熟玄參的有效物質含量，留作下一步考察研究。

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