NGF重組腺病毒在螺旋神經節細胞中的轉染特性

池 君，宋武戰，范泉水，張學淵，劉 丹，游建軍

研究表明，螺旋神經節細胞中存在著微量的神經生長因子（nerve growth factor,NGF），其細胞中亦分布著NGF的高效受體TrkA[1-2]，NGF要通過與其受體TrkA結合，啟動細胞內的信號途徑而發揮保護神經元、促進神經元存活等作用。由于耳蝸螺旋神經節細胞（spiral ganglion neurons，SGNs）在聽覺損傷和恢復中發揮重要作用，如何利用轉基因技術提高細胞中NGF含量，使SGNs能在耳蝸內長期存活，將為感音神經性耳聾的基因治療提供新的途徑。本實驗將外源性NGF通過腺病毒導入SGNs中，觀察轉染后SGNs的變化和存活時間。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 選用出生后3 d健康的SD大鼠10只（20耳）（購自昆明醫學院實驗動物中心，許可證號SYXK2005-0004），雌雄不限。隨機分成兩組，每組5只（10耳）。A組為NGF重組腺病毒轉染組，B組為非轉染組。攜帶有小鼠NGF基因的重組腺病毒制備參考文獻[3]。

1.2 腺病毒轉染離體培養的螺旋神經節細胞 耳蝸螺旋神經節細胞的分離、培養參考文獻[4]。A組中，當螺旋神經節細胞培養至第 時，將 孔板中原有的培養液吸出一半，加入500 μl腺病毒液；37℃5%CO2細胞培養箱中孵育2 h，再加入新的細胞培養液；48 h后半量換液；B組不加入病毒液，培養同前。每天觀察細胞形態和熒光變化，兩組細胞均培養14 d。

1.3 蛋白質免疫印跡檢測轉染前后SGNs中NGF的變化 終止培養后，A、B兩組分別行蛋白質免疫印跡檢測。按常規制備10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳，5%積層膠中電壓為80 V，樣品進入分離膠后電壓調至120 V；電泳完畢后，將凝膠上的蛋白質電轉至硝酸纖維素膜（NC）上。麗春紅染色觀察是否有蛋白質條帶，然后進行下一步操作。封閉1 h，孵育兔抗鼠多克隆抗體NGF（一抗）（北京博奧森生物技術有限公司），稀釋倍數1∶500，4℃過夜；TBST液漂洗3次，15 min/次，浸入含HRP標記的羊抗兔IgG （北京中山生物技術有限公司，1∶1000）的二抗中，37℃ 1 h，TBST液漂洗3次，15 min/次， 化學發光法顯影，X膠片記錄結果。

2 結果

2.1 B組離體培養的螺旋神經節細胞 在分離培養的螺旋神經節細胞中，種植后24 h，可見6孔板底部有細胞貼壁，此時細胞突起短，隨著培養時間的延長，突起逐漸長出。培養第5 d，可見SGNs胞體多呈橢圓形，胞體周圍呈現一圈光暈，胞體邊緣光滑，細胞透明，胞漿均質，折光性好。細胞突起細長，突起的長度一半大于胞體直徑的2～3倍，可見軸漿多處局部膨起，少數細胞的突起相互交織（圖1）。培養第10 d，部分細胞突起消失，胞體呈不規則形，貼壁差，少數細胞漂浮在培養液中（圖2）。培養至第14 d時，多數細胞漂浮，細胞崩解死亡。

2.2 A組離體培養的螺旋神經節細胞 培養開始至加入腺病毒前，SGNs的形態同B組。重組腺病毒轉染SGNs后第2 d（即培養5 d），倒置顯微鏡下可見SGNs貼壁良好，熒光顯微鏡下可見部分細胞胞體和突起發出熒光，強度較弱（圖3）；第5 d（即培養8 d），約有80%～90%的細胞發出熒光，強度增強，細胞形態結構正常，貼壁良好，許多細胞的突起交織成網（圖 4）。 第 11 d（即培養 14 d），約 50%細胞仍有熒光發出，半數細胞貼壁良好（圖5）。分別對離體培養10 d的兩組SGNs計數，B組細胞較A組顯著減少（P ＜ 0.05）。

圖1 離體培養5 d的SGNs（×100）

圖2 離體培養10 d的SGNs（×100）

圖3 重組腺病毒轉染第2 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達（×100）

圖4 重組腺病毒轉染第5 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達（×200）

圖5 重組腺病毒轉染第11 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達（× 200）

2.3 兩組NGF在SGNs中的表達 重組腺病毒轉染A組后，采用蛋白質免疫印跡法分別檢測兩組的NGF含量，結果A組的NGF總蛋白灰度值的均數為 0.718 24±0.036 92，顯著高于 B 組的 0.243 58±0.007 58（P ＜ 0.01，圖 6），提示轉染后 A 組螺旋神經節細胞中NGF的含量高。

圖6 蛋白質免疫印跡法檢測NGF在SGNs中的表達左側B組；右側A組

3 討論

迄今已有多種體系的真核表達載體，生物載體以缺陷型病毒表達載體為主，利用病毒對動物細胞的天然感染力，將目的基因表達單位成功導入宿主細胞內。螺旋神經節細胞屬終末分化的神經元細胞，腺病毒是一種雙鏈、無包膜DNA病毒，宿主范圍廣，可感染人體多種組織細胞，包括分裂期和非分裂期細胞（如神經細胞和心肌細胞），在基因治療的研究中，其轉染效率和安全性日益提高和完善[5-6]。本實驗發現，腺病毒轉染SGNs后第2 d，部分細胞胞體和突起發出熒光，提示腺病毒進入細胞內并開始表達目的基因。轉染第5 d，多數細胞感染病毒并發出較強熒光。轉染第11 d，部分細胞熒光轉弱甚至消失，顯微鏡下示細胞突起變短、崩解，漂浮，不貼壁。表明腺病毒能順利進入生長良好的SGNs細胞并在其中表達目的基因，表達時間約14 d左右，這為外源基因干預離體SGNs細胞的途徑提供了一定的實驗基礎。

神經生長因子是一種高效多能的神經營養因子，廣泛存在于動物體內，由 種亞基 按α2βγ2的排列組成，其中只有β亞基具有生物學作用。在神經元發育成熟期，具有維持感覺神經元和中樞神經元群的功能、促進成熟神經元軸索分支等作用。研究表明，NGF對神經嵴起源的耳蝸-橄欖束具有誘向和營養作用。Lefebvre等[7]觀察到，外源性NGF能促進離體培養的SGNs軸突延長。Staecker等[8]認為，NGF及其受體不僅影響出生后耳蝸神經元的凋亡和神經支配的分布，而且對于防護受損神經元的變性具有一定的潛能。本實驗中，在培養第72 h通過腺病毒將NGF導入SGNs，觀察到轉染第2 d（即培養第5 d）綠色熒光蛋白即在某些細胞中表達，發出熒光的神經元貼壁良好，軸突長，細胞的形態與非轉染組比較沒有明顯差別。隨著培養天數的增加，發出熒光的細胞數不斷增多，熒光表達也逐漸增強，同對照組相比，神經元的胞體較大，軸突明顯延長，許多細胞的軸突相互交織成網，提示導入SGNs中的NGF刺激了胞體和突起的生長。

Kromer[9]切斷SD大鼠雙側腦中隔到背部海馬的所有膽堿能神經纖維，制成腦損傷模型，然后向腦內注入NGF或細胞色素C，2 w后測定神經元存活率，結果細胞色素C組僅18%，而NGF組為84%，比對照組升高3.5倍，故認為在各種中樞神經損傷后應用外源性NGF可維持神經元生存。本實驗觀察了在正常培養條件下NGF對SGNs生存時間的影響，結果培養第11 d，SGNs細胞貼壁良好，形態正常；培養第14 d，轉染組仍有50%SGNs發出熒光，細胞貼壁良好，細胞的形態沒有明顯改變，交織成網的突起也沒有回縮。而非轉染組中培養的SGNs在培養第10 d時即有部分細胞突起消失，胞體變形甚至死亡；培養第14 d時大多數細胞胞體已經變形，突起縮短甚至消失，多數細胞胞體內出現空泡，胞體崩解。從培養存活的時間上，可以初步推測NGF對離體培養的SGNs存活具有促進作用。

本實驗將攜帶有NGF基因的腺病毒轉染離體培養的螺旋神經節細胞，病毒成功進入細胞并表達目的基因，被轉染的細胞存活時間延長，為離體SGNs的保護研究提供了一條可行的途徑。

[1]池君，張學淵，宋武戰.豚鼠耳蝸不同發育階段神經生長因子的分布及其意義[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007,42（5）:386-387.

[2]CF Dai,PS Steyger,ZM Wang,et al.Expression of Trk A receptors in the mammalian inner ear[J].Hear Res,2004,187（1）:1-11.

[3]池君，張學淵，宋武戰.小鼠神經生長因子基因重組腺病毒的構建及其在基底膜上的表達 [J].中華耳科學雜志,2007,5（2）:207-211.

[4]池君,宋武戰，范泉水,等.耳螺旋神經節細胞的培養及重組腺病毒在細胞中的表達[J].西南國防醫藥,2013,23（4）:349-351.

[5]Kamimura K,Suda T,Zhang G,et al.Advances in gene delivery systems[J].Pharmaceut Med,2011,25（5）:293-306.

[6]Nadeau I,Kamen A.Production of adenovirus vector for gene therapy[J].Biotechnol Adv,2003,20（7-8）:475-489.

[7]Lefebvre PP,Van de Water TR,Staecker H,et al.Nerve growth factor stimulates neurite regeneration but not survival of adult auditory neurons in vitro[J].Acta Otolaryngol,1992,112（2）:288-293.

[8]Staecker H,Li D,Malley BW,et al.Gene expression in the mammalian cochlea:a study of multiple vector systems[J].Acta Otolaryngology,2001,121（2）:157-163.

[9]Kromer LF.Nerve growth factor treatment after brain injury prevents neuronal death[J].Science,1987,235（4785）:214-216.