158例涂陰培陽肺結核患者分離菌株耐藥情況分析

周麗平 侯雙翼 劉勛 李愛國 趙丁源 楊成鳳 張玉 皮琦 羅軍民 彭延

?

·論著·

158例涂陰培陽肺結核患者分離菌株耐藥情況分析

周麗平 侯雙翼 劉勛 李愛國 趙丁源 楊成鳳 張玉 皮琦 羅軍民 彭延

目的 了解湖北省涂陰培陽肺結核患者分離菌株耐藥水平，為有效控制耐藥結核病提供依據。方法 采用WHO推薦的比例法，對湖北省內的4個國家級耐藥監測點2013年獲得的158例涂陰培陽患者的臨床分離株進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，其中一線抗結核藥物有異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)4種；二線抗結核藥物有卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、對氨基水楊酸(PAS)、丙硫異煙胺(Pto)5種。采用Excel建立數據庫，采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，對耐藥率的比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。結果 分離的158 株菌株總體耐藥率為18.99%(30/158)，耐多藥率為1.90%(3/158)，一線藥物S的耐藥率最高為13.29%(21/158)，二線藥物Cm的耐藥率最高為3.80%(6/158)。9種藥物耐藥率由高到低的順位分別為S 13.29%(21/158)、H 9.49%(15/158)、Cm 3.80%(6/158)、R 3.16%(5/158)、PAS 2.53%(4/158)、Km 1.90%(3/158)、E 1.27%(2/158)、Ofx 1.27%(2/158)、Pto 0.63%(1/158)。9種藥物均出現了耐藥菌株，共出現了15種不同耐藥形式。4種一線藥物耐藥率為15.82%，與湖北省1999年耐藥監測4種一線藥物初始耐藥率17.5%比較基本持平，差異無統計學意義(χ2=0.25,P>0.05)。結論 涂陰培陽肺結核患者分離株有較高的耐藥率，應引起重視，加強監測，進行規范治療和管理。

結核, 肺； 抗藥性, 細菌； 微生物敏感性試驗

我國結核病控制工作已經取得較大的成效，實現了階段性目標，但耐藥結核病的流行，為結核病的有效控制增加了難度。近年來，隨著耐藥結核病實驗室診斷的逐步開展，全國和各省對結核病耐藥情況進行了監測，但研究數據多來源于對涂陽培陽肺結核患者耐藥情況的分析，對涂陰培陽肺結核患者耐藥情況尚少見報道。據我國肺結核疫情報告顯示，目前全國活動性肺結核患者中絕大多數為涂陰肺結核患者[1]，本研究通過收集158例涂陰培陽肺結核患者菌株進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，分析涂陰培陽肺結核患者耐藥現狀。

材料和方法

一、研究對象

1. 標本的來源：湖北省浠水、麻城、天門、隨州4個國家級耐藥監測點2013年1月1日至12月31日，共新登記活動性肺結核患者2677例，發現涂陽患者470例，涂陽檢出率17.56%(470/2677)，新登記的涂陰肺結核患者2207例；新登記的涂陰患者中男1613例、女594例，最大年齡88歲，最小年齡8歲，平均年齡(49.36±17.79)歲；將每位涂陰患者收集2份質量較好的痰標本，進行分離培養，獲得陽性培養物168例，涂陰培陽率為7.61%(168/2207)；將168例陽性培養物送省結核病參比實驗室進行菌種鑒定和藥敏試驗，轉種失敗1例，進行菌種鑒定9株為非結核分枝桿菌，158株為結核分枝桿菌復合群；對158株結核分枝桿菌進行一、二線共9種抗結核藥物的敏感性檢測。

2. 新登記的涂陰培陽肺結核的界定：指從未用過抗結核藥物治療或用抗結核藥物化療不足1個月(因其他疾病應用抗結核藥物治療除外)，痰涂片檢查為陰性，痰培養檢查為陽性的肺結核。

二、實驗方法

1．涂片、培養和菌種鑒定： 按照中國防癆協會《結核病診斷實驗室檢驗規程》[2]進行。

2. 藥敏試驗： 采用WHO《結核病藥物耐藥性監測指南》[3]推薦的比例法對分離菌株進行藥敏試驗檢測。對異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)4種一線抗結核藥物和卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、對氨基水楊酸(PAS)、丙硫異煙胺(Pto)5種二線抗結核藥物進行檢測。各含藥培養基內的藥物濃度分別為：H 0.2 μg/ml，R 40 μg/ml，S 4 μg/ml，E 2 μg/ml，Km 30 μg/ml，Cm 40 μg/ml，Ofx 2.0 μg/ml，PAS 1.0 μg/ml，Pto 40.0 μg/ml。結果判定：以試驗管(含藥培養基)菌落數與對照管(不含藥培養基)菌落數之比計算耐藥百分比，若耐藥百分比>1%則認為受試菌對該抗結核藥物耐藥，<1%則為敏感[3-5]。

3．實驗材料：抗酸染色液、酸性羅氏培養基、改良羅氏培養基、菌種鑒定培養基和含藥培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司，結核分枝桿菌標準株H37Rv由國家結核病參比實驗室提供。

三、質量控制

(1) 涂片鏡檢和培養的質量保證按常規國家相關規定執行[6-7]。(2) 藥敏試驗由國家參比室對湖北省結核病參比實驗室進行藥敏試驗質量控制，參比室藥敏試驗結果符合率達到要求，方可對收集臨床株進行耐藥性檢測。(3)每批藥敏試驗均用結核分枝桿菌標準株(H37Rv敏感株)檢測含藥培養基的質量。試驗中，若高稀釋度菌液在對照培養基上生長<20 CFU/ml，則從對照管傳代培養，重復試驗。

四、統計學分析

采用Excel建立數據庫，對所有數據進行雙人錄入和復核，采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，對耐藥率的比較進行卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、抗結核藥物在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

在158例涂陰培陽菌株中，敏感菌株128株，耐任一藥物菌株30株，總耐藥率為18.99%(30/158)，耐多藥(至少同時耐R+H)菌株3株，耐多藥率為1.90%(3/158)。其中不同形式耐4種一線藥物的耐藥率為15.82%(25/158)，與我省1999年全省耐藥監測4種一線藥物初始耐藥率17.5%基本持平，差異無統計學意義((χ2=0.25,P>0.05)。5種二線藥物的耐藥率6.96%(11/158)，4種一線藥物加Ofx和Km 2種二線藥物的耐藥率為17.72%(28/158)。9種藥物耐藥率由高到低的耐藥順位依次為S、H、Cm、R、PAS、Km、E、Ofx、Pto；S的耐藥率最高[13.29%(21/158)]，Pto的耐藥率最低[0.63%(1/158)]，二線藥物中Cm的耐藥率最高[3.80% (6/158)](表1)。

二、不同抗結核藥物的耐藥形式在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

9種藥物均出現了耐藥菌株，30株耐藥菌株共出現了15種不同耐藥形式，其中單耐藥13株，占43.33%(13/30)，多耐藥14株，占46.67%(14/30)，耐多藥3株,占10.00%(3/30)，對R耐藥的5株菌株中3株同時耐H， 沒有出現廣泛耐藥菌株(表2)。

表1 9種抗結核藥物在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

表2 不同抗結核藥物的耐藥形式 在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

三、不同特征涂陰培陽患者的耐藥情況

患者從未用過藥與用藥<1月，耐藥率分別為19.01%(27/142)和18.75%(3/16)，耐藥率之間差異無統計學意義(χ2=0.00,P>0.05)。不同性別患者耐藥率分別為男19.66%(23/117)、女17.07%(7/41)，耐藥率之間差異無統計學意義(χ2=0.20,P>0.05)。男女的各個年齡組的耐藥率情況見表3。

討 論

我國是全球22個結核病流行嚴重的高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的高負擔國家之一[8]，耐藥結核病的增多與傳播已成為全球結核病發病率急驟上升的原因之一，特別是耐多藥肺結核的發生對結核病的控制造成了極大的威脅[9]，掌握結核病疫情和結核分枝桿菌耐藥情況，對結核病預防與控制具有非常重要的意義。目前國內外耐藥監測報道均以涂陽肺結核患者及分離菌株耐藥情況為主，本研究對涂陰培陽肺結核患者耐藥情況進行了分析。

一、耐藥疫情較嚴重，應加強耐藥監測

本次涂陰培陽肺結核患者分離的158株菌株中，9種藥物總耐藥率為18.99%，4種一線藥物耐藥率為15.82%，耐多藥率為1.90%，與我省1999年全省耐藥監測4種一線藥物初始耐藥率17.5%(χ2=0.25,P>0.05)和初始耐多藥率2.1%(χ2=0.03,P>0.05)比較基本一致[10]。4種一線藥物加2種二線藥物(Ofx和Km)總耐藥率17.72%，略高于2008年全球72個國家和地區初治涂陽17.00%的平均總耐藥率[11]。說明湖北省涂陰培陽肺結核患者分離株耐藥率較高，耐藥疫情比較嚴重，應進一步加強患者的發現、治療與管理，加強結核病患者的耐藥監測。

二、耐藥譜廣泛，耐藥順位發生變化

9種藥物均出現了耐藥菌株，且出現了15種不同耐藥形式，說明涂陰培陽菌株耐藥譜廣泛。耐藥率順位前五位為S、H、Cm、R、PAS，其中仍然以S耐藥率為高，目前結核病常規治療方案中， S不再是

表3 各年齡組不同性別涂陰培陽患者臨床分離株耐藥率

應用于患者治療的必選藥物，因此S高耐藥可能與早期主要應用S抗結核和抗炎治療有關，同時抗結核藥物治療不超過1個月與未用過抗結核藥物治療患者的分離株耐藥情況無差別，均說明患者很可能是由于既往感染了具有耐藥性的菌株，為原發耐藥，原發耐藥是耐藥結核病產生的重要原因[12]。二線藥物中Cm、PAS耐藥率排位靠前，Cm排在總順位第三位，5種二線藥物均出現耐藥，說明我省二線藥物使用廣泛，有待規范，二線藥物耐藥形式不容樂觀。R耐藥的5株菌株中同時耐H的3株，提示加強涂陰培陽患者的R耐藥監測有利于提高耐多藥患者的發現。

三、年齡組間耐藥率差異有統計學意義

經過單項有序卡方檢驗，年齡對藥敏試驗結果的影響差異有統計學意義。0～歲年齡組耐藥率最低(0.00%)，20～歲年齡組耐藥率最高(29.27%)。與李靜等[13]、黨麗云等[14]、何佩賢等[15]報道的情況類似，可能與該年齡段人群生活壓力大、生活不規律、一些不良的生活習慣等導致其抵抗力下降，以及流動性大、集體工作生活機會多導致感染機會增多，治療依從性較差等因素有關。在我國改革開放、經濟發展的新形勢下耐藥趨勢在發生改變，應加強對20～歲年齡段，特別是男性20～歲年齡段耐藥情況的研究，及時采取干預措施。

涂陰培陽患者實際上是痰涂片檢查時沒被發現而通過培養的方法發現的細菌學陽性患者。2010年全國第五次結核病流行病學調查顯示，活動性患者中涂陰患者占85.65%，其中涂陰培陽率為14.17%，占活動性患者的比例為12.14%[1]，本研究涂陰培陽率達到7.61%，說明活動性患者中存在相當數量的涂陰培陽患者，亦存在一定數量的耐藥患者，應關注涂陰培陽患者對結核病疫情及耐藥結核病疫情的影響。

通過對涂陰培陽患者耐藥情況的分析，發現涂陰培陽患者耐藥情況比較嚴重，提示我們在結核病防治規劃制定和結核病防治策略實施過程中應重視涂陰肺結核患者的發現，將痰培養檢查納入結核病常規檢查項目，提高涂陰培陽患者的發現率，加強涂陰培陽患者的耐藥監測，及早發現耐藥患者，選擇適當的治療方案，規范的進行治療和管理，從而有效避免涂陰患者因治療不當所致的治療失敗，避免耐多藥和廣泛耐多藥患者的產生。

[1] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組 全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室．2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508.

[2] 中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006:46-65.

[3] Mohamed AA，Adalbert L，Mario R，et al. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis．2nd ed．Geneva：World Health Organization，2003：l-71．

[4] World Health Organization．Guidelines for drug susceptibility testing for second-line anti tuberculosis drugs for dots-plus．WHO/CDS/TB/2001．288．Geneva：World Health Organization, 2001．

[5] World Health Organization．Policy guidance on．drug-susceptibility testing(DST)of second-line anti tuberculosis drugs．WHO/HTM/TB/2008．392．Geneva：World Health Organization，2008．

[6] 趙雁林，姜廣路，夏輝，等.痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊.北京：中國協和醫科大學出版社，2008:18-39.

[7] 趙雁林，王黎霞，成詩明，等.分枝桿菌病分離培養標準化操作及質量保證手冊.北京：人民衛生出版社，2013:37-49.

[8] 張賀秋，趙雁林，馮曉燕，等.現代結核病診斷技術.北京：人民衛生出版社，2013:4-5.

[9] 鄭蓉蓉，張向東，黃成基．875株結核分枝桿菌耐藥情況分析.現代預防醫學，2008，35(23)：4697-4698.

[10] 李國明，吳興榮，張緹，等．湖北省結核分枝桿菌耐藥性監測研究．中華結核和呼吸雜志，2002，25(12):723-726.

[11] 中華人民共和國衛生部．全國結核病耐藥性基線調查報(2007—2008年)．北京：人民衛生出版社，2010：l-57．

[12] 梅建，薛楨，沈鑫，等．原發耐藥是耐藥結核病產生的重要原因．中華結核和呼吸雜志，2006，29(2):75-78.

[13] 李靜，張陽奕，武潔，等．2007—2012年上海市結核病耐藥趨勢分析. 中國防癆雜志，2014，36(1)25-30.

[14] 黨麗云，魏香蘭，方如塘，等.4721例住院肺結核患者耐藥狀況及危險因素分析.中國防癆雜志，2014，36(1)49-54.

[15] 何佩賢，黎婉媚，康莉娟.321例耐多藥結核病耐藥情況分析.中國防癆雜志，2012，34(8)：514-518.

(本文編輯：王然 薛愛華)

Drug resistance analysis of 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive tuberculosis

ZHOULi-ping,HOUShuang-yi,LIUXun,LIAi-guo,ZHAODing-yuan,YANGCheng-feng,ZHANGYu,PIQi,LUOJun-min,PENGYan.

InstituteforTuberculosisControlandPrevention,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan430079,China

PENGYan,Email: 68633845@qq.com

Objective To understand the drug-resistant level of strains isolated from patients with smear-ne-gative and culture-positive tuberculosis (TB) in Hubei, and to provide basis for effectively control drug-resistant TB. Methods Proportion method recommended by World Health Organization (WHO) was applied. Drug susceptibility test (DST) of H, R, S, E (the first-line anti-TB drugs) and Km, Cm, Ofx, PAS, Pto (the second-line anti-TB drugs) for 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB from 4 national drug-resistance monitoring sites in Hubei in 2013 was conducted. Database was established using Excel. Statistical analysis was performed with SPSS 16.0. Chi-square test was used to test drug-resistance rate withP<0.05 as statistically significant difference. Results The overall drug-resistance rate of 158 strains was 18.99% (30/158), and the multi-drug resistant rate was 1.90% (3/158). Specifically, the drug-resistance rates of S and Cm were 13.29% (21/158) and 3.80% (6/158), which were respectively the highest among the first line and the second line drugs. Moreover，the drug-resistance rates of 9 drugs from high to low were S 13.29% (21/158), H 9.49% (15/158), Cm 3.80% (6/158), R 3.16% (5/158), PAS 2.53% (4/158), Km 1.90% (3/158), E 1.27% (2/158), Ofx 1.27% (2/158) and Pto 0.63% (1/158). Drug-resistant strains appeared to 9 drugs, and there were a total of 15 different forms of resistance. All in all, the drug-resistance rate of 4 kinds of first-line drugs was 15.82%, which kept basically balance with the monitoring data 17.5% in Hubei in 1999 (χ2=0.25,P>0.05). Conclusion The drug resistance rates of the isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB are higher, which should be paid attention to, we should strengthen surveillance, and standardize treatment and management as well.

Tuberculosis, pulmonary； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.011

430079 武漢， 湖北省疾病預防控制中心結核病防治研究所

彭延，Email: 68633845@qq.com

2015-01-29)