葒草的體外抗腫瘤活性研究

張玲艷　高翔　王曉玲

【摘要】目的：篩選葒草的抗腫瘤活性部位。方法：采用CCK8法觀察葒草各提取部位對人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞株生長的影響情況。結果：葒草的乙酸乙酯部位對人肺癌A549及肝癌HepG2細胞的生存率降至49.16%及57.44%；正丁醇部位對人肺癌A549及肝癌HepG2細胞的生存率降至39.18%和46.57%，呈現時間-劑量效應關系。結論：葒草對人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞增值具有一定的抑制作用，是具有開發前景的抗腫瘤中藥。

【關鍵詞】葒草；CCK8法；體外抗腫瘤；活性部位

【中圖分類號】R285.5【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0033-02

葒草為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L.的干燥地上部分，具祛風除濕、清熱解毒、活血、消積止痛之功，用于治療風濕痹痛、頭痛、心胃氣痛、小兒疳積等癥[1]。其主要成分為黃酮類化合物[2]，且該成分有顯著抑制腫瘤細胞增殖的作用[3]。文獻報道葒草對一些腫瘤細胞具有抑制作用，紅蓼的果實、莖葉也有一定的抗腫瘤作用[4-6]。本研究采用CCK8法，初步探討了葒草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位對人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞體外活性的抑制情況，為葒草的進一步研究及臨床抗腫瘤的開發提供實驗依據。

1儀器與材料

1.1儀器酶標儀（美國，Thermo Scientific Multiskan FC）；二氧化碳培養箱（美國，Thermo Fisher）；倒置相差顯微鏡（德國，徠卡DM500/DM750顯微鏡）；96孔培養板（美國Corning公司）；電子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；Mill-Q型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2材料 葒草采自天津經濟開發區，經天津中醫藥大學張堅鑒定為葒草Polygonum orientale L.的地上部分；胰蛋白酶、1640高糖培養基、胎牛血清為美國GIBCO公司；CCK8試劑盒為碧云天生物有限公司；其他試劑皆為分析純；水為由Mili-Q超純水；人肺癌細胞株A549、人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2方法

2.1供試品制備稱取葒草100g粉碎至60目，用3倍體積的60%的乙醇回流提取三次，每次1h，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，回收溶劑，減壓回收，得石油醚、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。冷凍干燥呈粉末，精密稱取不同提取部分干燥粉末，用培養基制成10mg/ml母液，過0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃備用。

2.2細胞培養將細胞接種于含10%胎牛血清100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的1640培養液中，放置37℃、5%CO2培養箱中培養，實驗細胞采用對數生長期細胞。

2.3CCK8法檢測細胞存活率選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液后，將細胞密度調整為5×104個/ml，每孔接種100μl的細胞懸液于96孔培養板中，置于5%CO2及飽和濕度下的培養箱內37℃培養12 h。每孔加入不同萃取部位藥物稀釋液，使其終濃度分別為50、100、150μg/ml，每組5個復孔，對照組加入相同體積培養基，置于37℃、5%CO2和飽和濕度下的培養箱內，繼續培養12h和24h。終止培養前1h，每孔加入100μl CCK8溶液，混勻，在細胞培養箱繼續孵育1h后，于酶標儀上490nm波長處檢測各孔的光密度OD值，按試劑盒說明，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=D（λ）實驗組/D（λ）對照組×100%，則對照組存活率為100%。

2.4數據分析采用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

3結果

3.1不同濃度對細胞存活率的影響石油醚層對人肺癌A459和人肝癌HepG2細胞存活率均沒有影響（P>0.05）。乙酸乙酯部位和正丁醇部位對兩種細胞株均具有一定的抑制作用。與石油醚組相比，作用12h、50μg/ml的乙酸乙酯部位藥物對腫瘤細胞的存活率無顯著性差異。隨著乙酸乙酯部位濃度升高至100μg/ml時，對A549細胞和HepG2細胞存活率分別降至70.46%和74.28%，200μg/ml時，兩種細胞存活率分別為56.74%和61.32%，與石油醚組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。結果顯示，乙酸乙酯部位出現良好的劑量依賴性。正丁醇部位在作用時間12h、濃度為50μg/ml時，A549細胞和HepG2細胞存活率分別為69.17%和78.59%，而200μg/ml正丁醇對兩種細胞的存活率影響分別為46.12和52.71%，與石油醚組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。結果顯示正丁醇部位對兩種細胞株也存在濃度-效應關系。并且相同藥物濃度、相同作用時間時，正丁醇部位對于兩種細胞比乙酸乙酯更為敏感。

3.2不同時間對細胞生存率影響相同濃度乙酸乙酯部位（100μg/ml）對A549細胞的存活率在12h和24h分別為70.46%和68.45%；HepG2細胞的存活率分別為74.28%和67.41%；正丁醇部位（100μg/ml）對A549細胞處理12h和24h，細胞存活率分別為64.19%和53.46%，而HepG2的影響分別為62.41%和58.43%，由此可見，隨著藥物作用時間的延長，藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用也隨之升高。

4討論

目前罹患癌癥的病例呈逐年增長的趨勢。癌癥是機體與外界環境因素長期相互作用的結果，主要誘因有環境污染及諸如吸煙、不健康飲食、體力活動少等不良的生活方式。我國肺癌及肝癌的發病率較高，死亡率在癌癥中也最高。隨著中醫藥現代化研究的深入，中藥在治療癌癥方面有了很大的進展。葒草為民間及民族常用中藥，文獻報道其有一定的抗腫瘤作用[3]。本文通過對葒草不同溶劑萃取物對肺癌A549細胞、肝癌HepG2細胞進行體外活性的篩選，為其抗腫瘤活性研究及臨床應用提供實驗依據及參考。

本實驗通過CCK8法，對葒草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位對人肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞進行體外活性的抑制作用進行研究，結果表明乙酸乙酯、正丁醇2個萃取部位對人肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞均有抑制增殖的作用影響，且正丁醇部位對上述兩種腫瘤細胞的增殖影響較大（生存率最低為39.18%和46.57%），比乙酸乙酯部位（最低值為49.16%、57.44%）抑制作用更明顯。說明葒草抗腫瘤的活性部位集中在大極性部分。并且，給藥劑量與給藥時間與腫瘤增殖抑制具有直接關系，隨著給藥劑量和給藥時間的增加，腫瘤細胞生存率降低，達到200μg/ml和24h時的影響最大。葒草的主要化學成分為黃酮類化合物，且黃酮類化合物具有一定的抗腫瘤作用，葒草的抗腫瘤活性是否與黃酮類成分的含量有關仍需進一步的實驗研究。

參考文獻

[1] 國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草（第二冊）[M].上海：上海科技出版社，1998：681-683.

[2] 陳秋榮.黃酮類化合物藥理作用的分析[J].中國實用醫藥，2012，7（21）：254-255.

[3] 李勇軍，何迅，劉志寶，等.葒草化學成分的研究[J].中國中藥雜志，2009，34（20）：2613-2614.

[4] 宋青，樓一層.紅蓼對腫瘤細胞的作用研究[J].中國藥師，2009，12（10）：1340-1342.

[5] 翟延君.水紅花子質量標準規范化研究[D].沈陽：遼寧中醫學院，2005：14-37.

[6] 佟苗苗，張宇瑤，初正云，等.葒草花提取物體外抗腫瘤活性研究[J].中國民族民間醫藥，2013，22（24）：7-8.

（收稿日期：2015.01.22）