基于生物效價的雙黃連制劑質量控制研究

李穆睿等

【摘要】目的：研究雙黃連制劑體外抗菌效價檢測方法，建立基于生物檢定的雙黃連制劑質量評價模式。 方法：按照中國藥典（2010版）規定的生物檢定法中的管碟法，以金黃色葡萄球菌為菌種，建立生物效價評價雙黃連制劑的方法，并對不同廠家的雙黃連口服液的抗菌效價進行測定。結果：雙黃連制劑體外抗菌實驗量效之間具有良好的線性關系，不同廠家的雙黃連口服液抗菌效價為10.278U～15.7276U。結論：生物效價檢測方法可以作為雙黃連制劑質量控制的一種方法。

【關鍵詞】雙黃連制劑；質量控制；生物效價；管碟法

【中圖分類號】R927.11【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0030-03

中藥制劑質量控制方法目前常用含量測定法，一般以某種或幾種有效成分為對照，但中藥制劑不同于成分單一的化學藥，其成分復雜，具有多成分、多靶點的藥理作用，僅依靠某種或幾種有效成分難以全面評價中藥質量，更難以體現中藥的整體效應。借鑒生物制品質量控制模式，建立中藥制劑基于生物效價檢測的中藥質量控制方法，用以完善現行的中藥質量控制體系[1]。

生物效價測定法是鑒定制劑質量的一種新方法，利用藥物對生物體所產生的影響，測定藥物的生物效價。用此方法控制中藥質量，可以對藥品的藥效、毒副作用進行評價，尤其對于某些理化方法無法探明含量、無法表征生物活性的中藥制劑更有其明顯的優越性。目前已有文獻采用生物鑒定法對含小檗堿類中藥進行研究[2]，以生物效應為為核心藥效控制藥材的質量，取得了一定進展。迄今為止，尚未見采用生物效價測定法控制成方制劑質量的研究報道。

雙黃連制劑由金銀花、黃芩、連翹組成，具有疏風解表、清熱解毒的功效。臨床用于外感風熱引起的發熱、咳嗽、咽痛[3]。本文以雙黃連相關制劑為例，對處方中三味藥材的生物效價進行系統研究，以期控制制劑的質量。為有效進行雙黃連制劑的質量控制研究，以多種不同廠家的雙黃連制劑為研究對象，以藥典規定的雙黃連含量測定成分為參考，制定基于生物效價的雙黃連制劑質量標準。

1儀器與材料

1.1儀器1/10萬電子天平（Sartorius公司，德國）；高溫高壓高濕滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；恒溫培養箱（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；血細胞計數板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；牛津杯[內徑（6.0±0.1）mm、外徑（7.8±0.1）mm、高（10.0±0.1）mm]；游標卡尺（上海寶琴工具有限公司）；陶瓦蓋。

1.2試劑慶大霉素（批號：130326-201015，標定效價為630U/mg，中國藥品生物制品檢定所提供）； 金黃色葡萄球菌[staphylocoeccus aureus CMCC（B）26003]（中國藥品生物制品檢定所）；營養瓊脂培養基（蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，北京陸橋技術有限責任公司）；水為無菌超純水；其余試劑均為分析純。

1.3藥品雙黃連口服液（批號：112112025，河南太龍藥業股份有限公司；批號：13052416，哈藥集團三精制藥股份有限公司；批號：10121321，河南太龍藥業股份有限公司；批號：20141020，東莞市亞洲制藥有限公司；批號：121021，河南福森藥業有限公司；批號：120905，南陽市新生制藥有限公司；批號：110317，哈爾濱匯利藥業有限公司；批號：B20130104，黑龍江珍寶島藥業股份有限公司；批號：110306，黑龍江瑞格制藥有限公司；批號：110506哈高科白天鵝藥業集團有限公司）。

2方法與結果

2.1試驗材料準備參照中國藥典（2010年版）二部“抗生素微生物檢定法-管碟法操作”[4]。

2.1.1標準品的制備精密稱取慶大霉素適量，加pH7.8的磷酸鹽溶液稀釋0.01μg/ml作為標準品儲備液。

2.1.2供試品的制備精密量取雙黃連口服液樣品5ml，至10ml容量瓶中，用無菌水定容至刻度，蒸汽滅菌30min，存于4℃保存備用。

2.1.3菌懸液的制備取金黃色葡萄球菌的營養瓊脂斜面培養物，另取營養瓊脂接種，在37℃下培養20～22h，取3、4代細菌的培養物，用無菌水將菌苔洗下后，制成懸液，使用血球計數板調節濁度為2.0麥氏比濁度，備用。

2.1.4雙碟的制備[5]于雙碟中加入高溫滅菌后的營養瓊脂培養基20ml，使其在碟內均勻平鋪，并在水平操作臺上冷卻凝固，作為底層。另取培養基適量，高溫滅菌后放冷至50℃，加入占培養基體積1%的懸菌液，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，作為菌層。待冷卻后，在每一雙碟中均勻等距放置6個牛津杯，備用。

2.2效價檢測的方法學檢查

2.2.1方法采用管碟法，測定標準品對實驗菌產生的抑菌圈直徑，進行分析考察。

2.2.2劑量反應關系考察取制備完畢的雙碟2只，分別均勻等距安置4個牛津杯，用陶瓦圓蓋覆蓋備用，分別取標準品按照1∶0.8劑距分別用磷酸鹽溶液稀釋至10、8、6.4、5.12、4.096、3.278、2.62、2.10μg/ml的溶液0.3ml加樣，置于37℃恒溫培養箱中培養20h，取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑D值，結果見表1。

以抑菌圈直徑D（mm）為橫坐標X，標準品濃度C（μg/ml）為縱坐標Y，經線性回歸，得回歸方程為Y=1.9273X+10.882，R2=0.9921，若以抑菌圈直徑D（mm）為橫坐標X，標準品濃度C（μg/ml）的對數為縱坐標Y，經線性回歸，回歸方程為Y=0.0381X，R2=0.9991。結果表明，在2.10～10μg/ml范圍內慶大霉素磷酸鹽溶液的對數值與抑菌圈直徑進行直線回歸處理，劑量反應關系系數R均大于0.99，說明慶大霉素磷酸鹽溶液的濃度在2.10～10μg/ml范圍內，與抑菌圈直徑有較好的量效關系。endprint

2.2.3精密度試驗取標準品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復測定5次，精密測量各抑菌圈直徑D值，計算相對標準偏差RSD值低于1%，具有較好的精密度。

2.2.4中間精密度試驗邀請不同試驗人員，在不同時間，取標準品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復測定5次，精密測量各抑菌圈直徑D值計算RSD值均低于2%，具有較好的中間精密度。

2.2.5穩定性試驗取供試品溶液，分別于0、l、4、8、24h按上述條件測定各抑菌圈直徑D值，計算RSD值均低于2%。結果表明，標準品溶液在24h內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗取標準品溶液，稀釋至6.4μg/ml，共5份，按上述條件測定各抑菌圈直徑D值，計算RSD低于1%。結果表明，所采用的測定方法重復性良好。

2.3試驗設計采用量反應平行線（3·3）法，隨機區組設計實驗，將標準品溶液和供試品溶液按照1∶0.8隨機分成高、中、低6組，前三組接受標準品的3個劑量，后三組接受供試品的3個劑量。取6只制備完成的雙碟，在每一雙碟中一側的3個牛津杯分別滴加高（SH）、中（SM）、低（SL）濃度的慶大霉素磷酸鹽溶液，另一側3個牛津杯分別滴加高（TH）、中（TM）、低（TL）3種濃度的雙黃連口服液供試品溶液，加樣量均為0.3ml，于37℃恒溫培養箱中培養20h后，精密測量各個抑菌圈直徑，使用生物檢定統計程序BS2000版[6-7]中的（3·3）法進行可靠性測驗、效價計算和試驗誤差估計。

2.4結果與小結

2.4.1效價計算結果，結果見表2。

2.4.2小結試驗應用生物檢定中的管碟法對不同廠家的雙黃連口服液進行抑菌效價的檢測，實驗結果均能通過可靠性檢測，表明雙黃連制劑可以通過量反應平行線（3·3）法進行效價計算和實驗誤差估計。由于1ml供試品溶液中含有0.5ml雙黃連口服液，上述檢測結果經過換算可以得出，不同廠家的雙黃連制劑抑菌效價存在差異，抗菌效價為10.278～15.7276U，因此暫定每1ml雙黃連口服液抑菌效價不得低于9.3300U。

3討論

3.1管碟法檢測條件的選擇與優化按照中國藥典（2010年版）二部微生物鑒定法管碟法測定樣品對雙碟中培養菌產生的抑菌圈，應用單因素實驗法確定培養菌接種量和培養時間對抑菌圈的影響。

3.2培養菌接種量的考察應用第3代金黃色葡萄球菌，菌懸液濁度分別調整為0.5、1.0、1.5、2.0麥氏比濁標準（MCF）。結果表明，菌懸液濁度在0.5～2.0MCF范圍內，抑菌圈直徑不明顯，當接種量為2.0MCF時，菌層生長良好并且抑菌圈分界清晰，因此2.0MCF為適宜的培養菌接種量。

3.3培養時間的考察在相同條件下，分別考察14.0、14.5、15.0、15.5、16.0h等不同培養時間對試驗抑菌圈產生的影響。結果表明，培養時間為15.0h時抑菌圈直徑（即效應值）較大，菌層生長良好并且抑菌圈分界清晰。因此培養時間選定為15.0h。

參考文獻

[1] 肖小河，金城，趙中振，等.論中藥質量控制與評價模式的創新與發展[J].中國中藥雜志，2007，32（14）：1377-1381.

[2] 方藝霖.含小檗堿類中藥品質生物評價與控制的初步研究[D].成都：成都中醫藥大學，2008：35-48.

[3] 王小平，劉雅華.貴州省習用金銀花抑菌作用初探[J].中國民族民間醫藥，1998，6（34）：40-41.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典二部[S].北京：化學工業出版社.2010：附錄93-95.

[5] 王美珍.培養基對抗生素效價測定的影響[J].中國民族民間醫藥，2010，18（3）：68.

[6] 沈連忠，李波.中國藥典生物檢定統計軟件BS2000For Windows9X[J].中國衛生統計，2000，17（6）：330.

[7] 張媛，譚德講.中國藥典生物檢定統計實例不同計算方式結果比較和幾點修改建議[J].藥物分析雜志2013，33（11）：1858-1861.

（收稿日期：2015.01.22）endprint