基于生物效價的雙黃連制劑質(zhì)量控制研究

李穆睿等

【摘要】目的：研究雙黃連制劑體外抗菌效價檢測方法，建立基于生物檢定的雙黃連制劑質(zhì)量評價模式。 方法：按照中國藥典（2010版）規(guī)定的生物檢定法中的管碟法，以金黃色葡萄球菌為菌種，建立生物效價評價雙黃連制劑的方法，并對不同廠家的雙黃連口服液的抗菌效價進(jìn)行測定。結(jié)果：雙黃連制劑體外抗菌實驗量效之間具有良好的線性關(guān)系，不同廠家的雙黃連口服液抗菌效價為10.278U～15.7276U。結(jié)論：生物效價檢測方法可以作為雙黃連制劑質(zhì)量控制的一種方法。

【關(guān)鍵詞】雙黃連制劑；質(zhì)量控制；生物效價；管碟法

【中圖分類號】R927.11【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0030-03

中藥制劑質(zhì)量控制方法目前常用含量測定法，一般以某種或幾種有效成分為對照，但中藥制劑不同于成分單一的化學(xué)藥，其成分復(fù)雜，具有多成分、多靶點的藥理作用，僅依靠某種或幾種有效成分難以全面評價中藥質(zhì)量，更難以體現(xiàn)中藥的整體效應(yīng)。借鑒生物制品質(zhì)量控制模式，建立中藥制劑基于生物效價檢測的中藥質(zhì)量控制方法，用以完善現(xiàn)行的中藥質(zhì)量控制體系[1]。

生物效價測定法是鑒定制劑質(zhì)量的一種新方法，利用藥物對生物體所產(chǎn)生的影響，測定藥物的生物效價。用此方法控制中藥質(zhì)量，可以對藥品的藥效、毒副作用進(jìn)行評價，尤其對于某些理化方法無法探明含量、無法表征生物活性的中藥制劑更有其明顯的優(yōu)越性。目前已有文獻(xiàn)采用生物鑒定法對含小檗堿類中藥進(jìn)行研究[2]，以生物效應(yīng)為為核心藥效控制藥材的質(zhì)量，取得了一定進(jìn)展。迄今為止，尚未見采用生物效價測定法控制成方制劑質(zhì)量的研究報道。

雙黃連制劑由金銀花、黃芩、連翹組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效。臨床用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛[3]。本文以雙黃連相關(guān)制劑為例，對處方中三味藥材的生物效價進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期控制制劑的質(zhì)量。為有效進(jìn)行雙黃連制劑的質(zhì)量控制研究，以多種不同廠家的雙黃連制劑為研究對象，以藥典規(guī)定的雙黃連含量測定成分為參考，制定基于生物效價的雙黃連制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1儀器與材料

1.1儀器1/10萬電子天平（Sartorius公司，德國）；高溫高壓高濕滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；恒溫培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；血細(xì)胞計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）；牛津杯[內(nèi)徑（6.0±0.1）mm、外徑（7.8±0.1）mm、高（10.0±0.1）mm]；游標(biāo)卡尺（上海寶琴工具有限公司）；陶瓦蓋。

1.2試劑慶大霉素（批號：130326-201015，標(biāo)定效價為630U/mg，中國藥品生物制品檢定所提供）； 金黃色葡萄球菌[staphylocoeccus aureus CMCC（B）26003]（中國藥品生物制品檢定所）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；水為無菌超純水；其余試劑均為分析純。

1.3藥品雙黃連口服液（批號：112112025，河南太龍藥業(yè)股份有限公司；批號：13052416，哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司；批號：10121321，河南太龍藥業(yè)股份有限公司；批號：20141020，東莞市亞洲制藥有限公司；批號：121021，河南福森藥業(yè)有限公司；批號：120905，南陽市新生制藥有限公司；批號：110317，哈爾濱匯利藥業(yè)有限公司；批號：B20130104，黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司；批號：110306，黑龍江瑞格制藥有限公司；批號：110506哈高科白天鵝藥業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1試驗材料準(zhǔn)備參照中國藥典（2010年版）二部“抗生素微生物檢定法-管碟法操作”[4]。

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)品的制備精密稱取慶大霉素適量，加pH7.8的磷酸鹽溶液稀釋0.01μg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

2.1.2供試品的制備精密量取雙黃連口服液樣品5ml，至10ml容量瓶中，用無菌水定容至刻度，蒸汽滅菌30min，存于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3菌懸液的制備取金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，另取營養(yǎng)瓊脂接種，在37℃下培養(yǎng)20～22h，取3、4代細(xì)菌的培養(yǎng)物，用無菌水將菌苔洗下后，制成懸液，使用血球計數(shù)板調(diào)節(jié)濁度為2.0麥?zhǔn)媳葷岫龋瑐溆谩?/p>

2.1.4雙碟的制備[5]于雙碟中加入高溫滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml，使其在碟內(nèi)均勻平鋪，并在水平操作臺上冷卻凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量，高溫滅菌后放冷至50℃，加入占培養(yǎng)基體積1%的懸菌液，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，作為菌層。待冷卻后，在每一雙碟中均勻等距放置6個牛津杯，備用。

2.2效價檢測的方法學(xué)檢查

2.2.1方法采用管碟法，測定標(biāo)準(zhǔn)品對實驗菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑，進(jìn)行分析考察。

2.2.2劑量反應(yīng)關(guān)系考察取制備完畢的雙碟2只，分別均勻等距安置4個牛津杯，用陶瓦圓蓋覆蓋備用，分別取標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶0.8劑距分別用磷酸鹽溶液稀釋至10、8、6.4、5.12、4.096、3.278、2.62、2.10μg/ml的溶液0.3ml加樣，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，取出，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑D值，結(jié)果見表1。

以抑菌圈直徑D（mm）為橫坐標(biāo)X，標(biāo)準(zhǔn)品濃度C（μg/ml）為縱坐標(biāo)Y，經(jīng)線性回歸，得回歸方程為Y=1.9273X+10.882，R2=0.9921，若以抑菌圈直徑D（mm）為橫坐標(biāo)X，標(biāo)準(zhǔn)品濃度C（μg/ml）的對數(shù)為縱坐標(biāo)Y，經(jīng)線性回歸，回歸方程為Y=0.0381X，R2=0.9991。結(jié)果表明，在2.10～10μg/ml范圍內(nèi)慶大霉素磷酸鹽溶液的對數(shù)值與抑菌圈直徑進(jìn)行直線回歸處理，劑量反應(yīng)關(guān)系系數(shù)R均大于0.99，說明慶大霉素磷酸鹽溶液的濃度在2.10～10μg/ml范圍內(nèi)，與抑菌圈直徑有較好的量效關(guān)系。endprint

2.2.3精密度試驗取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復(fù)測定5次，精密測量各抑菌圈直徑D值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值低于1%，具有較好的精密度。

2.2.4中間精密度試驗邀請不同試驗人員，在不同時間，取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，按上述條件重復(fù)測定5次，精密測量各抑菌圈直徑D值計算RSD值均低于2%，具有較好的中間精密度。

2.2.5穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，分別于0、l、4、8、24h按上述條件測定各抑菌圈直徑D值，計算RSD值均低于2%。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋至6.4μg/ml，共5份，按上述條件測定各抑菌圈直徑D值，計算RSD低于1%。結(jié)果表明，所采用的測定方法重復(fù)性良好。

2.3試驗設(shè)計采用量反應(yīng)平行線（3·3）法，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計實驗，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液按照1∶0.8隨機(jī)分成高、中、低6組，前三組接受標(biāo)準(zhǔn)品的3個劑量，后三組接受供試品的3個劑量。取6只制備完成的雙碟，在每一雙碟中一側(cè)的3個牛津杯分別滴加高（SH）、中（SM）、低（SL）濃度的慶大霉素磷酸鹽溶液，另一側(cè)3個牛津杯分別滴加高（TH）、中（TM）、低（TL）3種濃度的雙黃連口服液供試品溶液，加樣量均為0.3ml，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后，精密測量各個抑菌圈直徑，使用生物檢定統(tǒng)計程序BS2000版[6-7]中的（3·3）法進(jìn)行可靠性測驗、效價計算和試驗誤差估計。

2.4結(jié)果與小結(jié)

2.4.1效價計算結(jié)果，結(jié)果見表2。

2.4.2小結(jié)試驗應(yīng)用生物檢定中的管碟法對不同廠家的雙黃連口服液進(jìn)行抑菌效價的檢測，實驗結(jié)果均能通過可靠性檢測，表明雙黃連制劑可以通過量反應(yīng)平行線（3·3）法進(jìn)行效價計算和實驗誤差估計。由于1ml供試品溶液中含有0.5ml雙黃連口服液，上述檢測結(jié)果經(jīng)過換算可以得出，不同廠家的雙黃連制劑抑菌效價存在差異，抗菌效價為10.278～15.7276U，因此暫定每1ml雙黃連口服液抑菌效價不得低于9.3300U。

3討論

3.1管碟法檢測條件的選擇與優(yōu)化按照中國藥典（2010年版）二部微生物鑒定法管碟法測定樣品對雙碟中培養(yǎng)菌產(chǎn)生的抑菌圈，應(yīng)用單因素實驗法確定培養(yǎng)菌接種量和培養(yǎng)時間對抑菌圈的影響。

3.2培養(yǎng)菌接種量的考察應(yīng)用第3代金黃色葡萄球菌，菌懸液濁度分別調(diào)整為0.5、1.0、1.5、2.0麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（MCF）。結(jié)果表明，菌懸液濁度在0.5～2.0MCF范圍內(nèi)，抑菌圈直徑不明顯，當(dāng)接種量為2.0MCF時，菌層生長良好并且抑菌圈分界清晰，因此2.0MCF為適宜的培養(yǎng)菌接種量。

3.3培養(yǎng)時間的考察在相同條件下，分別考察14.0、14.5、15.0、15.5、16.0h等不同培養(yǎng)時間對試驗抑菌圈產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)時間為15.0h時抑菌圈直徑（即效應(yīng)值）較大，菌層生長良好并且抑菌圈分界清晰。因此培養(yǎng)時間選定為15.0h。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2015.01.22）endprint