黑逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠行為學及血清腫瘤壞死因子α及白細胞介素-6和-1β的影響*

楊長生，吳紅彥，李海龍，容倩倩

甘肅中醫學院，甘肅蘭州730000

黑逍遙散對阿爾茨海默病模型大鼠行為學及血清腫瘤壞死因子α及白細胞介素-6和-1β的影響*

楊長生，吳紅彥△，李海龍，容倩倩

甘肅中醫學院，甘肅蘭州730000

目的：觀察黑逍遙散對β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）所致阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）模型大鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-6、IL-1β）表達的影響，探討黑逍遙散防治AD的作用機制。方法：海馬區注射Aβ25-35建立AD大鼠模型，用黑逍遙散、石杉堿甲進行對抗治療，第28天取血清，通過酶聯免疫吸附法（ELISA）測定AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量。結果：模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，各治療組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均有所降低，黑逍遙散高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低。結論：有效控制AD患者體內炎性因子表達是黑逍遙散的重要作用機制。

阿爾茨海默病；黑逍遙散；炎性因子

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種以認知功能下降為特征的漸進性腦退化綜合征，是老年期癡呆的主要類型。目前AD的病因尚不明確，近年來有證據顯示炎性細胞因子(CK)參與AD的神經病理損傷，血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL-6、IL-1β)水平升高在AD發病機制中起重要作用[1]。中醫學認為，腦與肝腎密切相關，本課題組提出運用黑逍遙散治療AD。前期研究證明黑逍遙散能明顯改善AD模型大鼠的學習記憶能力[2]，本實驗觀察黑逍遙散對AD模型大鼠血清中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響，探討其對AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠100只，體質量(200±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供，實驗動物質量合格證編號：SYXK(甘)2013-0001058。

1.2 藥物與試劑 黑逍遙散(熟地黃、柴胡、當歸等)各組成生藥由甘肅中醫學院附屬醫院中藥房提供。制成濃度為2.0、1.0、0.5 g/mL的水煎液。放置于無菌容器中，4℃冰箱保存備用；石杉堿甲片購自河南太龍藥業股份有限公司，批號：130402，配制成濃度為0.001 8mg/mL水溶液，4℃冰箱保存備用；Aβ25-35購自上海強耀生物科技有限公司，批號：20130309。將Aβ25-35 10μg溶于生理鹽水1μL，使用前37℃孵育1周，使其呈凝聚態備用；IL-1、IL-6、TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號：20130609。

1.3 儀器 WT-200型大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司提供)、酶標儀(美國伯樂公司提供)、微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠提供)。

1.4 方法

1.4.1 模型復制 模型大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉，固定于立體定位儀上，確定海馬區注射點。用牙科鉆在顱骨上鉆孔(直徑1mm)，用微量進樣器在兩側各緩慢注射Aβ25-35溶液1μL，5分鐘內注射完，留針5分鐘，牙科泥封住顱骨孔，術區滴慶大霉素，縫合皮膚并消毒。假手術組注射等量生理鹽水，其余同模型組。

1.4.2 分組及給藥 100只大鼠經環境適應性飼養1周后稱重，按隨機數字表法選15只大鼠為假手術組，剩余大鼠造模7天后（除去死亡等不合格大鼠10只）稱重，再按隨機數字表法將大鼠分為模型組、石杉堿甲組、黑逍遙散高、中、低劑量組，每組15只。治療組各組處方量均按照《中藥藥理研究方法學》人與實驗動物體表面積折算等效劑量比換算，黑逍遙散各組大鼠分別按低劑量組4.25 g/(kg·d)、中劑量8.50 g/(kg·d)、高劑量17.0 g/(kg·d)灌胃給藥；石杉堿甲組每天灌胃石杉堿甲溶液0.018mg/kg；假手術組、模型組大鼠每天灌胃等容量生理鹽水，連續治療28天。

1.4.3 大鼠血清采集及測定IL-1β、IL-6及TNF-α治療28天后，將大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，股靜脈取血。靜置2小時后，4℃、3 000 r/min離心10分鐘，取血清置Eppendor f管中，4℃冰箱保存待測。血清IL-1、IL-6及TNF-α測定均采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)，按試劑盒操作說明進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計量資料采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與石杉堿甲組比較，中低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 黑逍遙散對AD大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影響 pg/mL

3 討論

AD臨床上表現為進行性認知障礙和精神異常，其病理特征為腦皮層及海馬區出現β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)聚集形成老年斑(seni le plaque，SP)，Tau蛋白異常聚集形成神經纖維纏結，其中老年斑伴有神經元突起損傷和小膠質細胞的活化。研究表明AD患者腦內存在強烈的局灶性炎癥反應，淀粉樣斑塊附近激活的小膠質細胞可表達IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎性因子［3］。小膠質細胞屬于單核巨噬細胞，正常情況下處于靜息狀態，Aβ形成后可激活神經系統中小膠質細胞，釋放大量炎性因子，誘發腦內炎癥反應或者直接損傷神經元［4］。同時炎性因子介導的炎性反應又可以促進Aβ的前體蛋白(APP)代謝為Aβ，從而加重炎性反應，形成惡性循環［5］。TNF-α是由小膠質細胞受Aβ刺激后產生的神經毒素，通過N-甲基-D-天門冬氨酸對神經元產生毒性作用［6］，此外TNF-α協同IL-1強烈誘導IL-6產生，研究發現IL-6誘導急性期蛋白A-2巨球蛋白的表達，其中A-2巨球蛋白的多態性使β-APP的正常酶解受到抑制，導致Aβ生成［7］。IL-1β可以誘發炎性反應，在細胞及體液免疫中起始動作用，IL-1β過度表達，可上調小膠質細胞表達IL-6、TNF-α等炎性因子，誘導APP過度生成；IL-1β還可激活絲裂原活化蛋白激酶P38的信號傳導通路，使Tau蛋白過度磷酸化，促進神經纖維纏結［8］。

黑逍遙散出自《醫略六書·女科指要》，由逍遙散加地黃組成，具有疏肝解郁，滋陰養血，益精填髓的功效。祖國醫學認為，AD病在腦，與肝藏密切相關，肝主疏泄，調暢氣機，又主藏血，調節血量，因此腦的供血賴于肝所藏之血及其疏泄功能。AD有記憶力減退，智力下降，情感失控等癥狀，與肝主情志思憶相關。老年人的病理基礎為腎精虧虛，不能生髓充腦，腦失滋養，漸成癡呆。本次實驗結果顯示，黑逍遙散各劑量組均能降低AD模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量，而黑逍遙散高劑量組較石杉堿甲組效果更明顯，說明高劑量黑逍遙散可能通過抑制炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達來防治AD。

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Effectsof HeiXiaoYao Pow der on the Behavior and the TNF-α,IL-6 and IL-1βContentsof Alzheim er D isease RatM odels

YANG Changsheng,WU Hongyan△,LIHailong,RONG Qianqian
Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To observe the effectof HeiXiaoYao powder on the ratsw ith A lzheimer disease(AD) induced by Aβ25-35 in the expression of tumornecrosis factor(TNF-α),interleukin-1β(IL-1β)and interleukin-6 (IL-6)in blood serum and to study the functionalmechanism of HeiXiaoYao powder in the prevention and treatment of AD.Methods:A fter the establishment of the AD ratmodels by injecting Aβ25-35 in the hippocampus,the models were treated by HeiXiaoYao powder and huperzine A.On the 28th day,the contents of TNF-α,IL-6 andIL-1βin the serum of themodelswere exam ined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results:The TNF-α,IL-6 and IL-1βcontents of the control group were increased hugely,while in the treatment group the contentsof TNF-α,IL-6 and IL-1βwere all decreased and the HeiXiaoYao powdergroup of high dosewere significantly decreased.Conclusion:The HeiXiaoYao powder can effectively control the expression of the inflammatory factor for AD patients,which isoneof importantmechanismsof HeiXiaoYao powder.

AD;HeiXiaoYao powder;inflammatory factor

R285.6

A

1004-6852(2015)02-0010-03

2014-07-29

國家自然科學基金項目(編號81060284)。

楊長生（1983—）女，在讀碩士研究生。研究方向：方劑作用機理及藥效基礎物質研究。

△通訊作者：吳紅彥（1963—）男，教授。研究方向：方劑藥理與新藥開發。