槲皮素對缺血再灌注大鼠肝臟損傷的保護作用

王甲甲，鐘佳伶，張娟，黃文芳

(四川省人民醫院，成都610072)

肝臟手術中缺血再灌注損傷的程度直接影響手術后肝臟功能及肝臟的存活力，且由于肝臟對缺血比較敏感，因此，有必要對如何減輕肝臟缺血再灌注損傷作深入地探討［1，2］。槲皮素是常見的類黃酮物質之一，很多研究已證實槲皮素可以通過直接清除活性氧自由基、抑制LDL及DNA氧化損傷等途徑發揮抗氧化作用，但對其在缺血再灌注損傷中的應用報道不多［3～5］。2013年 4～8月，本研究利用大鼠肝臟缺血再灌注模型來評價槲皮素對缺血再灌注損傷不同時限肝臟功能和形態學的影響，并對其作用機制作初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠80只，體質量 (250±20)g，被隨機分為4組:正常對照組5只、假手術組25只、缺血再灌注組25只和槲皮素組25只，后3組再按不同灌注時限(0、6、12、24、72 h)分為5個亞組，每個亞組5只。

1.2 動物模型的建立 對照組:斷頸法處死后直接入腹切肝;假手術組:3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，經尾靜脈輸注50 mL/kg生理鹽水，開腹后僅游離肝蒂，不作阻斷;缺血再灌注組:麻醉及輸液同假手術組，解剖肝門，鉗夾肝蒂45 min后再復流;槲皮素預處理組:術前經尾靜脈輸注50 mL/kg槲皮素注射液，麻醉及手術方法同缺血再灌注組。

1.3 標本收集 上述實驗結束后，分別收集大鼠的血液于無抗凝劑添加管中，待其凝固后于常溫離心機上2 000 r/min，離心5 min收集血清，并分裝保存于-20℃冰箱。摘取其肝臟，用剪刀剪成小塊分裝于2 mL凍存管中，置于-80℃冰箱保存或浸泡于10%的甲醛溶液中固定、石蠟包埋、常規切片備檢。

1.4 檢測方法 ①肝功能的檢測:新鮮大鼠血清于全自動生化分析儀上檢測ALT、AST水平;②細胞因子水平的檢測:用競爭抑制ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平，IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒均購自 R＆D公司，具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行，繪制標準曲線，計算各樣品中細胞因子的含量;③肝組織病理學分析:HE染色法檢測各組肝組織的形態學變化情況;④肝臟細胞凋亡情況的檢測:采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d-UTP缺口末端標記技術(TUNEL)法檢測肝臟細胞的凋亡情況。切片在400倍光鏡下隨機計數6個視野，計算每100個細胞中凋亡細胞所占比例，即凋亡指數(AI)。TUNEL試劑盒購自美國Roche公司。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，數據經正態檢驗如符合正態分布，以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量設計的方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組ALT、AST及血清細胞因子水平比較 缺血再灌注組血清中ALT、AST、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平與對照組或假手術組同時間點相比差異有統計學意義(P均＜0.05)，且以12 h組差異最明顯;槲皮素組血清中 ALT、AST、IL-1β、IL-8、TNF-α 水平與缺血再灌注組同時間點相比差異有統計學意義(P均＜0.05)。見表1。

表1 各組血清ALT、AST及細胞因子水平比較(±s)

表1 各組血清ALT、AST及細胞因子水平比較(±s)

注:與對照組或假手術組同時間點比較，*P＜0.05;與缺血再灌注組同時間點比較，#P＜0.05。

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) IL-1β(μg/mL) IL-6(μg/mL) IL-8(μg/mL) TNF-α(μg/mL)對照組 5 36.42± 5.21 45.27±4.33 31.75± 6.28 51.42± 5.74 62.51±8.25 24.87± 4.11假手術組0 h 5 35.49± 4.16 44.26± 4.02 32.25± 4.05 52.35± 6.01 64.33± 5.77 25.91± 3.60 6 h 5 36.35± 3.85 43.65± 4.75 33.05± 5.73 49.25± 6.94 65.15± 5.16 24.47± 5.64 12 h 5 36.23± 6.72 44.86± 6.24 34.28± 5.41 49.41± 7.01 67.21± 7.47 26.42± 4.05 24 h 5 36.57± 3.86 47.25± 6.22 32.42± 5.82 50.25± 7.97 66.85± 6.48 25.26± 4.22 72 h 5 37.61± 4.70 46.49± 5.15 36.25± 6.65 51.35± 4.73 65.85± 5.49 23.92± 6.08缺血再灌注組0 h 5 92.54± 9.42* 116.27±9.05* 54.68± 5.63* 104.59± 6.35* 121.07± 5.77* 43.33± 8.17*6 h 5 103.21±10.44* 119.35±11.35* 104.05±10.77* 116.36± 9.85* 126.91± 7.09* 94.76± 8.03*12 h 5 125.92±11.88* 135.47±15.46* 122.28± 9.47* 135.52± 9.56* 142.35±11.68* 135.65±12.29*24 h 5 110.35±12.51* 121.21±14.57* 109.66± 9.05* 119.69±11.47* 119.81±12.56* 127.51±12.99*72 h 5 105.18± 9.56* 118.35±10.09* 102.38± 5.42* 116.59±10.27* 118.45±11.06* 109.44±12.49*槲皮素組0 h 5 52.49± 6.47# 64.45±7.21# 40.40±5.23# 95.44± 6.77 71.50±8.74# 36.45± 8.91#6 h 5 59.47± 6.01# 67.71±8.42# 71.41±8.06# 109.24± 7.66 84.37±9.06# 62.38± 5.96#12 h 5 63.32± 8.49# 71.65± 8.75# 86.50± 8.42# 127.58± 9.62 99.46± 8.05# 91.26±13.05#24 h 5 57.35± 6.35# 68.39±7.11# 82.25±6.75# 112.44± 8.05 89.25±6.99# 86.72± 9.75#72 h 5 51.45± 8.28# 67.75± 4.92# 76.48± 8.06# 109.86± 8.75 85.49±10.59# 82.36±11.50#

2.2 肝臟形態學變化 對照組及假手術組肝細胞光鏡下觀察形態結構正常，未見明顯細胞水腫。缺血再灌注組肝臟外觀肉眼無明顯改變，光鏡下肝細胞明顯氣球樣變，肝竇受壓，無明顯肝索結構，匯管區有大量的淋巴細胞浸潤，且伴有部分灶狀壞死;再灌注后12 h，壞死程度最嚴重，細胞形態變化最明顯。槲皮素組與缺血再灌注組同時間點相比，肝細胞僅輕度水腫、疏松化，肝竇部分受壓，但未見肝細胞壞死。

2.3 TUNEL染色結果 TUNEL染色肝臟凋亡細胞的胞核呈黃褐色，非凋亡細胞的胞核呈藍紫色。各組肝臟TUNEL染色的AI值分別如下:對照組為(2.05±0.75)%;假手術組0、6、12、24、72 h 分別為(3.15 ±1.05)%、(4.35±1.15)%、(3.65±0.55)%、(3.65±0.65)%、(3.55±0.55)%，各時間點比較差異無統計學意義(P 均 ＞0.05);缺血再灌注組 0、6、12、24、72 h分別為(17.15±2.45)%、(26.25±3.75)%、(23.75±4.65)%、(19.15±3.05)%、(18.45±2.25)%，6 h時最高，組內與其他時間點相比有統計學差異(P均＜0.05);槲皮素組0、6、12、24、72 h 分別為(10.85 ±2.05)%、(12.45±1.95)%、(11.25±0.85)%、(11.35±0.95)%、(10.75±1.45)%，與缺血再灌注組同時間點相比差異有統計學意義(P均＜0.05)。

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷的病理生理機制非常復雜，目前尚未完全闡明。大多數研究認為缺血再灌注損傷與氧自由基生成過多、鈣超載、炎癥反應、能量代謝障礙、細胞凋亡等有關［6～9］。槲皮素及其衍生物是植物界分布廣泛，具有多種生物學功能的黃酮類化合物，其生物學作用包括抗氧化及清除自由基、抗腫瘤、抗炎、抗纖維化作用等［10～12］。目前，關于槲皮素與缺血再灌注損傷之間的研究并不多，且機制不明。本研究旨在探討槲皮素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，也為解決肝臟缺血再灌注損傷提供新的思路，為臨床合理利用槲皮素提供一定的實驗依據。

在本研究中，我們首先成功地建立了大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，并對大鼠缺血再灌注損傷及槲皮素處理后0、6、12、24、72 h 5 個時間點大鼠血清中ALT、AST的水平進行檢測。ALT、AST是非特異性的細胞內酶，ALT主要存在于肝細胞質中，AST在心肌細胞內含量最高。正常情況下二者血清中含量很低，當肝細胞膜通透性增高時釋放入血，這兩者常用來反映肝細胞損傷的程度［13，14］。本研究結果顯示，肝臟發生缺血再灌注損傷后12 h血清中ALT、AST的水平達到峰值，之后即有所下降。與缺血再灌注組同時間點相比，槲皮素組血清中ALT、AST的水平顯著下降。光鏡下通過對大鼠肝臟組織形態學的觀察發現，對照組和假手術組無明顯的形態學變化;在缺血再灌注組，肝臟細胞有大量的壞死，尤以12 h時間點最為嚴重;而在槲皮素組的相同時間點，肝臟細胞的壞死程度明顯減輕。這些研究結果從功能學和形態學方面初步表明槲皮素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有保護作用。

目前，關于缺血再灌注損傷與氧自由基生成過多方面的報道很多［15，16］，而關于缺血再灌注損傷與炎癥因子、細胞凋亡方面的報道較少，該研究即著重從這兩方面對槲皮素保護大鼠肝臟缺血再灌注損傷的作用機制進行闡述。TNF-α是具有多種生物學效應的重要促炎因子之一，其釋放較早，且可激活細胞因子級聯反應，誘導白介素和其他次級炎癥介質的合成與釋放［17］。為了進一步探討槲皮素保護肝臟作用是否與炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 有關，我們對其相關性作了研究。研究發現，對照組和假手術組這4種炎癥因子水平較低，且跟缺血再灌注時間無明確相關關系;槲皮素可能是通過下調IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平發揮其保護肝臟作用。

以往人們普遍認為，肝臟缺血再灌注損傷時細胞以壞死的方式發生死亡。如今更多的觀點認為，細胞凋亡在此過程中起重要作用，凋亡已成為當前研究肝臟缺血再灌注損傷發病機制的熱點之一［18］。我們對缺血再灌注后不同時間點肝臟的AI進行檢測，發現對照組與假手術組AI與時限沒有明顯相關性。在缺血再灌注組，再灌注后6 h的AI最高，且槲皮素能夠有效地減輕肝臟細胞的凋亡程度。這些結果提示槲皮素保護肝臟缺血再灌注損傷的作用可能與抗細胞凋亡有關。

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